模式生物-费俭1

模式生物概论及基因工程小鼠的研制和应用考题：1．小鼠的常规基因剔除和条件性基因剔除有什么不同，后者主要通过什么手段来达到条件剔除的目的？2．请简述目前在生物医药研究中常用的模式生物有哪些（试举3种以上不同进化层次的生物）？它们各自的研究优势是什么？3．在进行小鼠基因剔除实验中，常用129小鼠的ES细胞和C57小鼠的囊胚，请说明有什么好处和缺点？4．小鼠基因敲除的一般步骤及其局限性？1．生物体由低等向高等、由简单向复杂的进化过程中，很多生物学过程在不同生物物种中是非常保守的。因此，可以通过选择合适的物种，对其开展研究，获得对生命基本规律或者人类健康的认识，这样的物种就称为模式生物。2．模式生物的选择有利于回答和解决研究者关注的问题，繁殖容易，周期短，研究成本低，遗传背景清楚，有遗传操作的手段，表型分析容易。3．常用的模式生物：（1）大肠杆菌（Escherichiacoli），属肠细菌家族（Shigella,Salmonella,Yersinia，etc），在自然界中广泛存在，适合实验室培养（可以液体培养和固体培养），安全，培养条件简单，生长迅速，克隆方便，基因操作简便，是分子生物学，遗传学和生物化学研究中的重要模式生物也用于人类感染性疾病和其他微生物研究的模式生物。1997完成测序，4.3M，4400基因，近一半功能不清。1961年，法国科学家莫诺（J·L·Monod，1910-1976）与雅可布（F·Jacob）通过研究大肠杆菌中乳糖代谢的过程，发表了“蛋白质合成中的遗传调节机制”一文，提出操纵子学说，开创了基因调控的研究。四年后的1965年，莫诺与雅可布即荣获诺贝尔生理学与医学奖。（2）酵母（Saccharomycescerevisiae），单细胞的真核生物，适合实验室培养（可以液体培养和固体培养），安全，克隆方便，基因操作简单，可以有丝分裂，也可以出芽繁殖，可以以单倍体和双倍体生长，是分子生物学，遗传学，生物化学，真核细胞周期调控，信号转导等研究的重要模式生物，16条染色体，12M，约6000个蛋白编码基因，基因结构紧凑。利兰·哈特韦尔以面包酵母（Saccharymycescerevisiae）为模型，分离出了控制细胞周期基因发生突变的酵母细胞。通过这种途径，他成功地鉴别了一百多种与控制细胞周期有关的特定基因，叫做CDC基因（细胞分裂周期基因）。其中CDC28是细胞进入G1阶段的“启动器”。保罗·纳斯用了另外一种酵母，裂殖酵母（Schizzosaccharomycespombe）作为模型发现了cdc2。该基因在控制细胞分裂（从G2阶段转变到有丝分裂）起关键作用。他们获得了2001年诺贝尔生理或医学奖。考恩伯格利用酵母为模式生物，用晶体学方法研究了真核细胞基因转录的过程，向人们描述了真核细胞如何实现不同的转录控制。（3）线虫（Caenorhabditiselegans），成虫大小：1mm，实验室饲养简单，生命周期短，保种方便，大部分为雌雄同体（雄虫占0.05%），N2是目前实验室常用的野生型品种，成虫由959个细胞构成（Caenorhabditiselegans），其中302个细胞为神经细胞；所有的细胞谱系清楚，成虫过程中有131个细胞经历凋亡，是研究发育（细胞命运决定）、神经系统的重要模式生物。遗传操作手段成熟（转基因和RNAi），基因组：5对常染色体，1对性染色体，97M，约20000个基因，“程序性细胞死亡”是细胞一种生理性、主动性的“自觉自杀行为”，这些细胞死得有规律，似乎是按编好了的“程序”进行的，犹如秋天片片树叶的凋落，所以这种细胞死亡又称为“细胞凋亡”。霍维茨、布雷内和劳尔斯顿分别以线虫为实验材料，建立了线虫模式生物遗传修饰系统，并对“程序性细胞死亡”过程中的基因调节进行了研究。正是由于在细胞凋亡方面的突出贡献，三位科学家获得了2002年诺贝尔生理学或医学奖。目前科学家们已经开始利用“程序性细胞死亡”的机理，研究多种疾病的新型治疗方法。RNA干扰是一个双链RNA以一种非常明确的方式抑制基因表达的生物过程。1998年法尔和梅洛分别以线虫为实验材料发现了RNA干扰机制，因而获得了2006年诺贝尔生理学或医学奖。目前，RNA干扰已经成为一种强大的“基因沉默”技术，不仅是研究基因功能的重要手段，不久的未来，这种技术也许能用来直接从源头上让致病基因“沉默”，以治疗癌症甚至艾滋病。（4）果蝇（Drosophilamelanogaster），个体小，3mm，适合实验室饲养，生命周期短（2周），繁殖力强（数百个卵），具有成熟的遗传操作的方法，具备众多的突变品系，有特殊的染色体结构（多线染色体，可分成102条区带），有比较复杂的行为能力，是遗传学，发育生物学理想的模式生物。3对常染色体，1对性染色体（X，Y）；165M，14000基因。托马斯·摩尔根（1866～1945），用果蝇证实了孟德尔定律，发现了果蝇白眼突变的性连锁遗传。因发现染色体在遗传中的作用而获得1933年诺贝尔生理学或医学奖。缪勒(1890～1967)，摩尔根的学生，被誉为“果蝇的突变大师”。因发现x线照射引起基因突变，为人工诱导突变开辟了重要途径而获得1946年诺贝尔生理学或医学奖。刘易斯、福尔哈德和威斯乔斯以果蝇为实验材料，通过喂食诱变剂的方法，获得了大量的果蝇突变体，发现了上百个控制胚胎早期发育的基因，揭开了胚胎如何由一个细胞发育成完美的特化器官,如脑和腿的遗传秘密，因而获得了1995年诺贝尔生理学或医学奖。这一成就敲开了人类发育遗传秘密的大门，将有助于解释人类先天性畸型的成因。阿克塞尔和巴克以果蝇为研究材料发现了一个由将近1000种不同基因组成的基因大家族，并从分子层面到细胞组织层面清楚地阐明了嗅觉系统的作用机理，因而获得2004年诺贝尔生理学或医学奖。（5）斑马鱼（Brachydaniorerio；zebrafish），个体小（4cm），淡水饲养，繁殖周期短（3个月），产仔频繁，量高，适合实验室养殖，脊椎动物，胚胎发育周期短，胚胎透明遗传操作方法成熟（Morpholino），具有大量突变体，已证明在多方面可以模拟人类疾病模型，25对染色体，168M，30000基因。（6）非洲爪蟾（Xenopuslaevis），21条染色体，2002年完成基因组测序，基因组340M，22000个蛋白基因。（7）小鼠（Musmusculus），最小的哺乳动物之一(25-40g)，世代周期短，生物进化上与人类接近(60-75百万年)，胎盘形成和早期胚胎发育与人类相近，组织器官结构和细胞功能与人类相似，有高级神经活动，小鼠基因组测序计划已完成，人类99%的基因存在于小鼠，基因同源性高达78.5%，基因组93%的区域基因排列顺序与人类相同相同，基因组改造的技术手段成熟。埃文斯在国际上首次建立了小鼠的胚胎干细胞，并证明了胚胎干细胞可形成生殖细胞；卡佩基和史密斯建立了哺乳动物细胞的同源重组技术；1989年三者共同努力建立了基因打靶技术，获得了第一只基因剔除小鼠。此后该技术在生物医药领域得到了广泛应用，目前已获得500多种不同的人类疾病小鼠模型，包括心血管疾病和神经退化类疾病、糖尿病和癌症等。正是由于这一开创性的工作，他们共同获得了2007年诺贝尔生理学或医学奖。（8）大鼠（Rattusrattus）。四篇paper：PPT44-644．转基因小鼠技术（1）受精卵单细胞原核注射（2）精子介导的转基因技术：可以用于小鼠ES细胞的转基因和胚胎（包括受精卵）的转基因，优点：比原核注射效率高，技术要求低；局限：最大插入容量10kb，需要制备病毒（3）病毒介导的转基因技术（逆转录病毒、Lentivirus）（4）穿膜肽（核定位蛋白）介导的基因转移（5）转座酶介导的基因转移5．用受精卵单细胞原核注射导入基因的特点•随机插入–单位点和多位点插入并存–多拷贝串连•插入位点及整合方式对转入基因表达的影响–插入位点影响–插入序列引发的denovo甲基化–同源性依赖的基因沉默–使用大片段的DNA，如BAC等–使用隔离子（Insulator如小鼠H19基因）来减少插入位点对转基因表达的影响•方法技术要求高，设备投入大6．转基因小鼠的繁育：决定所需要的小鼠品系背景，首建者分别和选定的野生型品系进行配种繁育，首建者小鼠之间不能进行相互交配，做好出生小鼠的标牌（出生日期，亲本信息），小鼠编号（1-2周），同时采集小鼠尾部组织或者耳轮组织，提取DNA，进行基因型鉴定（genetyping），对阳性小鼠进行断奶、雌雄分笼。7．转基因载体构建（1）获得所需要表达蛋白的cDNA（2）选择合适的基因表达启动子（3）保证转录后的正确加工8．大片段DNA的转基因小鼠构建需求：基因或基因簇（组）功能研究，调控序列的研究技术特点：BAC和YAC(100和200kb或者更大)，载体构建方法采用同源重组；ET克隆整合位点对基因表达的影响减少，基因表达的强度和整合的拷贝数正相关，大片段DNA的粘度和易受剪切破坏给完整片段的整合带来困难。9．基因调控序列的研究及报告基因•启动子；增强子；负调控元件等等•常用的报告基因–E.colib-半乳糖苷酶(lacZ)•底物:ONPG;MUG;X-gal–E.coli葡糖苷酸酶(gusA)•底物:X-gluc–荧光素酶(luc)•底物:luciferin–绿色荧光蛋白(GFP)等报告基因载体构建10．可诱导的基因表达方法利用内源性可诱导的启动子：热休克蛋白，hsp70基因，金属硫蛋白基因。重组型的可诱导启动子：LacI；tet-onortet-off；蜕皮激素；化合物诱导的二聚化（CID）。蛋白水平的诱导：ER受体融合蛋白/Tamoxifen，重组酶系统。11．小鼠基因剔除技术（knockout）流程图：SelectareportgeneIncorporatethepromoterelementsyouwanttodriveexpressionpromoterPositiveandnegativeregulators;tissuespecific;enhancerelementsReportGenePolyA利用DNA同源重组技术和胚胎干细胞（ES细胞）发育全能性的原理，先将待剔除的基因制成缺失突变型，在缺失的位置上插入一个选择基因如新霉素抗性基因(neo)，同时再接上另一个选择基因如胸苷激酶基因(tk)。将这一段带有已失去原有功能的待剔除基因的DNA片段装在载体上，通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)转入在体外培养的小鼠胚胎干细胞(embryonicstemcells，EScells)。在细胞内，通过同源重组将基因组里有功能的待剔除基因剔除掉。然后通过有效的筛选方法，通常用PCR技术，southernblot技术或PNS（positive-negativeselection）筛选出目的基因被敲出的干细胞，注射进小鼠早期胚胎，将产生的缺失杂合体小鼠同野生型小鼠杂交，将获得的杂合体后代交配，从子代中选出该基因缺失的纯合体，其概率为四分之一。具体见PDF费俭212．基因打靶技术的局限性•胚胎致死•所有细胞都改变•功能代偿•冗余•单元与系统的关系常规方法的缺陷在于：它使得实验个体的所有细胞都被改变，往往引起严重的发育缺陷和早期胚胎死亡；在培养纯系小鼠的过程中，有些基因的互补效应也增加了表型分析的复杂性；另外，由于广泛应用neo和HSVtK作为正负选择系统，发生同源重组的细胞基因组中总留有外源的选择标记(neo)基因；该基因可能影响相邻基因的表达，不利于对突变表型的精确分析。