牛血清白蛋白的分离提纯工艺

课程设计说明书课程名称：生物分离工程设计题目：牛血清白蛋白的分离提纯工艺院系：环境与化学工程学院学生姓名：孙盼盼学号：41004020111专业班级：10级生物工程01班指导教师：王晓军2013年6月20日目录1.设计任务书………………........................……………………………………12.设计背景…………………....................…………………………….…………12.1牛血清白蛋白分离提纯的简介………....................…………12.2牛血清白蛋白分离提纯的意义.………...............……………13.设计原理……............………………………………........………………24.设计工艺流程及设计方案说明…....................…………………24.1对原材料的粗分级分离……..........……………………………34.2对粗分离成分进行细分级分离……..........……………………34.3蛋白的结晶与重结晶……..........………………......…………34.4对分离出的蛋白质进行纯度鉴定……..........…………..……34.5牛血清白蛋白质分离提纯的整个工艺流程……............……35.操作过程……..........………………………………..……………45.1蛋白质分离的准备阶段……..........………………....…………45.2细分级分离设备的设计……..........……………………....……45.3蛋白质的纯度鉴定……..........…………………………............86.参考文献……..........…………………...........…………...………87.课程设计心得……..........……………………......................…911.设计任务书现有一混合物料液中含有酪蛋白（分子量：57000Da，pI4.5）、β-乳球蛋白（分子量：35000Da，pI5.1）、α-乳白蛋白（分子量：14000Da，pI4.2）和牛血清白蛋白（分子量：66200Da，pI4.7），设计一个分离纯化工艺纯化其中的牛血清白蛋白。2.设计背景2.1牛血清白蛋白分离提纯的简介蛋白质是（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%~20%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。蛋白质具有很多生物化学共性，运用相关性质进行蛋白质的分离制备多种不同的单一蛋白质，更好的为人们所有。蛋白质的分离提纯技术已经很成熟，相关的工艺流程包含各种不同的分离提纯设备，这些设备运用蛋白质的不同原理对其进行分离纯化，单一蛋白质的分离提纯在现实生活中具有重要意义！2.2牛血清白蛋白分离提纯的意义牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫2键，在肽链的第34位有一自由巯基。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66200Da，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在westernblot中作为Blockingagent。3.设计原理采用等电点沉淀、凝胶过滤、亲和层析等方法对蛋白质进行分离提纯，对相关分离提纯所需条件可通过与电脑相连的方式进行精确控制，并在此基础设计相关仪器分离提纯蛋白质，在分离提纯过程中运用到的蛋白质一些性质：分子大小、溶解度、等电点、吸附特性等。根据生物分离原则：先纯化，再脱盐，最后成品加工。初步纯化采用盐析沉淀法，高度纯化采用二维电泳。盐析沉淀原理：蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。4.设计工艺流程及设计方案说明34.1对原材料的粗分级分离当蛋白质提取液获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来。一般该步分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。4.2对粗分离成分进行细分级分离这一步也就是样品的进一步纯化。样品经粗分级分离以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化，一般使用层析法，还可以选用电泳、等电聚焦作为最后的纯化步骤。等电聚焦电泳就是使电泳的介质中形成一定范围的pH梯度，电泳时待分离的两性分子可以在这种pH梯度中迁移，直到聚集于与其等电点相同的区域。该技术特别适用于分子量相近而等电点不同的蛋白质分离和分析。我们在设计完成自己创新的蛋白质电荷分离仪时就是依据等电聚焦的相关原理完成的，因此等电聚焦电泳分离蛋白质就是我们设计分离蛋白质的基本依据。4.3蛋白的结晶与重结晶结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤，结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白质。结晶并不能保证蛋白质一定是均一的，但只有某些蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。4.4对分离出的蛋白质进行纯度鉴定蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学的方法，如电泳、沉淀、HPLC和溶解度分析等。纯的蛋白质和还有杂质的蛋白质在电泳等测量时会表现出不同的动向故而能够进行纯度的鉴定。4.5牛血清白蛋白质分离提纯的整个工艺流程4工艺流程：动植物组织或细胞，细菌细胞裂解破碎→得到蛋白质提取液→通过盐析、等电点沉淀等方法除去其中的杂质→的到体积较小，杂蛋白较少的蛋白提取液→经过层析、电泳、等电聚焦等方法进一步分离纯化蛋白→结晶→重结晶→纯度的鉴定→纯度过低时重复以上几步操作→得到单一牛血清白蛋白5.操作过程5.1蛋白质分离的准备阶段方法:盐析其原理由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水变成了盐离子的水化水，那些被迫与蛋白质表面的疏水基团接触并掩盖它们的水分子成为下一步最自由地可以利用的水分子，因此留下暴露出来疏水基团的蛋白质，随硫酸铵的进一步加入，蛋白质疏水基团进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集沉淀。在上步溶有蛋白质的缓冲液内加入中性盐硫酸铵，随着硫酸铵的加入，当离子浓度足够高时，缓冲液中的蛋白质会沉淀下来，这样就得到了蛋白质的粗提物，这步主要利用了盐析原理。通过以上两个步骤完成蛋白质的初级分离，为下一步细分级分离做好准备。5.2细分级分离设备的设计基于蛋白质分离的准备阶段，对所要的目的蛋白进行分离创新设计仪器名称：蛋白质电荷分离仪5所设计仪器原理：蛋白质在非等电点溶液中带电，在外加电场作用下会向相反电极移动；蛋白质在等电点时溶解度最低且不带电荷，在外加电场下不会移动。精确控制分离缓冲液的pH，利用电泳作用分离带点蛋白质和不带电蛋白质。主要过程包括以下两方面要点：a、精确地控制反应容器内液体的pH，b、自由电泳分离带电蛋白质。所用器材：滴定管、铁架台、夹子、带孔玻璃板、下部带有出口圆形玻璃器皿、磁力搅拌器、pH计、电脑、电极、电源、透析纸袋等。蛋白质电荷分离仪的主要构成：固定装置、反应装置、搅拌装置、控制装置、电泳装置。仪器介绍：a.固定装置主要组成：铁架台、夹子、玻璃板等主要用途：用于固定滴定管，方便调节pH的液体（酸、碱、水）的滴加，再者固定与电极相连的电线，使装置处于相对比较稳定的状态。此装置位于分离仪器的最上部。b.反应装置主要组成：下部带有出口圆形玻璃器皿、透析纸袋等主要用途：用于盛装反应液，pH计测定反应液的pH，电泳过程等主要反应过程都在这里面进行。此装置位于分离仪器的中部。c.搅拌装置名称：磁力搅拌器6原理:利用磁性物质同性相斥的特性，通过不断变换基座的两端的极性来推动磁性搅拌仔转动。适用于粘稠度不是很大的液体，或者固液混合物利用了磁场和漩涡的原理，将液体放入容器中后；将搅拌子同时放入液体；当底座产生磁场后带动搅拌子成圆周循环运动，从而达到搅拌液体的目的。用途：当滴定管液体滴入反应容器时会造成反应液各处pH不均匀，磁力搅拌器将液体搅匀，便于下面pH计的准确测定。d.电泳装置组成：电极、电源、电线等分类：自由电泳、区带电泳原理：生物大分子如蛋白质，核酸，多糖等大多都有阳离子和阴离子基团，称为两性离子。常以颗粒分散在溶液中，它们的静电荷取决于介质的H+浓度或与其他大分子的相互作用.在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移，迁移的方向取决于它们带电的符号，这种迁移现象即所谓电泳。如果把生物大分子的胶体溶液放在一个没有干扰的电场中，使颗粒具有恒定迁移速率的驱动力来自于颗粒上的有效电荷Q和电位梯度E。用途：达到特定蛋白质等电点时，蛋白质溶解度最低且不带电荷，在外加电场作用下不会向两极移动；其它蛋白质在特定蛋白质的等电点时不是它们自己的等电点，因此带点，在外加电场下会移动。用pH计精确控制分离缓冲液的pH，达到特定蛋白质的等电点，让后自由电泳，将特定蛋白质与其它蛋白质分离开来。e.控制装置名称：pH计7组成：一个参比电极；一个玻璃电极，其电位取决于周围溶液的pH；一个电流计，该电流计能在电阻极大的电路中测量出微小的电位差。分类：1.按测量精度可分0.2级、0.1级、0.01级或更高精度。2.按仪器体积分有笔式（迷你型）、便携式、台式还有在线连续监控测量的在线式。3.根据使用的要求笔式（迷你型）与便携式PH酸碱度计一般是检测人员带到现场检测使用。原理：用电位法测定溶液的pH值是最基本的方法。电位测量pH的原理来源于能斯特公式。如把一支对氢离子可逆的电极和一支参比电极放人溶液中，就组成了原电池。由于原电池中参比电极的电位在一定条件下是不变的，那么原电池的电动势的数值就随着被测溶液中氢离子的活度而变。因此，可以通过测量原电池的电动势，计算溶液中的pH值。操作过程：在带有出口圆形玻璃器皿底部铺上一层透析纸袋，将带孔玻璃板盖在下部带有出口圆形玻璃器皿上，（不易用方形玻璃器皿，因为搅拌时候易造成液体飞溅，容器内已经注有一定pH的缓冲液)，滴定管和电极电线穿过玻璃板孔向容器内滴加液滴（视情况滴加酸、碱、纯水，液滴的量要精确控制，以免pH受到较大波动），在滴加液滴的同时打开磁力搅拌器缓慢搅拌，使溶液各处pH均匀，在此期间经校正的pH计严格监视溶液pH的变化，随液滴的滴加pH达到被分离蛋白质的等电点（之所以没有提前加入被分离蛋白质样品是避免pH波动对被分离蛋白质活性的影响），停止滴加液滴，加入被分离蛋白质样品，再次测溶液pH并且调整溶液pH至被分离蛋白质的等电点。以上操作主要是为了找到被分离蛋白质的等电点，并没有进行电泳操作，上述操作完成后，停止pH计的测量，打开电泳操作进行电泳，由于8被分离蛋白质在等电点pH处不带电，故而不移动，其它带点蛋白质会在电场作用下向相反电极移动（控制电压可以改变带电蛋白质的移动速度），从而分离出目标蛋白质，然后通过下部带有出口圆形玻璃器皿的出口取出被分离液，将透析纸袋取出，获取目标蛋白质，将其储存起来，关闭出口，再换一张透析纸袋，将出口的分离液再次倒进反应装置里，再次打开磁力搅拌器缓慢搅拌，调整pH至刚分离的蛋白质的等电点，然后重复上述操作，进一步分离目标蛋白质，提高被分离蛋白质的产量