vector-nti-11--使用教程---第八章-核酸引子设计

第八章核酸引子设计53第八章　核酸引子设计　VectorNTI有引子设计的功能，用户可以根据实验的需求，设计使用者所需之特定核酸引子。首先在主程序中用户将PCR反应的区段序列用光标选取，接着进入Analyses→PrimerDesign(图8.1)：图8.1选取PCR反应的区段，设计特定核酸引子　此项目可以提供用户根据不同的实验需求进行引子设计。可以将设计好的引子进行存取和分析，也可以将设计好的引子资料传送Invitrogen进行引子合成。　FindPCRPrimers：进入这个项目后用户会先看到一个窗口(图8.2)：图8.2FindPCRPrimers窗口，要进阶设定，点选MoreVectorNTI教育训练手册54　使用者可以根据实验的需求来设定相关的条件：上方RegionofAnalysis可以填入欲分析的序列范围；ProductLength可以设定使用者PCR所夹的序列长度。中间MaximumNumberofOutputOptions可以设定引子组数，下面的参数是可以设计引子的特性，如Tm值及引子长度等等。若要在引子两端加入限制酶剪切序列可以点选：图8.3FindPCRPrimers进阶设定，在引子两端可加入限制酶剪切序列　使用者可以在下方Attachto5’terminus(图8.3)点选加入欲设定的限制酶即可；上方User-DefinedPrimers的项目可以把在LocalDatabase中现有的引子资料直接使用。以海大斑马鱼基因为例子，设计一个两端带有EcoRI和NdeI的限制酶片段、Tm值介于55到60、GC含量介于50到60、长度介于20到40、欲夹的序列全长及引子数目，设定好相关条件后按下确定(图8.4)：第八章核酸引子设计55图8.4FindPCRPrimers设定完后按下”确定”　这时用户在文字窗口(图8.5)的下方字段可以看到多出一个PCRAnalysis的文件夹，上面会显示用户设计的引子数据：图8.5文字窗口，增加了PCRAnalysis的数据VectorNTI教育训练手册56　在这个字段中使用者首先看到序列会被一个空格切成两部分(图8.6蓝色部分)，左边的序列为使用者加入限制酶的序列；右边的序列为设计的引子序列。在每组的正向和反向引子下方会显示序列的相关数据，用户想要储存结果只要选取引子，接着按下鼠标右键：图8.6选取序列字段后右键单击，对引子进行储存动作　使用者可以点选SaveToDatabase(图8.7)：图8.7储存引子到数据库　存取方式和前一章所介绍的作法是完全相同的，存盘的默认路径指向LocalDatabase中的Oligos文件夹里（如同前一章所介绍的方式，使用者也可以在LocalDatabase中建立属于自己的引子档案夹）。如果想要输出序列，可以点选CopyItemData进行输出(图8.8)：第八章核酸引子设计57图8.8将引子输出至记事本　若是直接订购引子，使用者可以点选Order的项目，这样子引子的数据就会送到Invrogen公司进行引子合成服务。AddtoOligoList功能和AddtoGelSampleList功能类似，一样会把引子数据暂存在窗口中，以便于进一步的分析。要开启OligoList时，使用者只要点选即可(图8.9)：图8.9开启OligoList，对引子进行编辑和分析VectorNTI教育训练手册58在OligoList项目下用户可以编辑和分析引子资料(图8.10)。　使用者如果要进一步分析引子的特性可以点选Analyze功能：图8.10编辑与分析引子数据　如图8.11所示，左手边可以先设定分析的条件，接着按下Analyze右边的字段就会显示分析的结果：图8.11左边字段为设定分析的条件，右边字段显示分析的结果　最右边的窗口会显示该引子回纹以及重复片段位置，其分析的条件在左手边字段中的Palindroms以及Nucl.Repeats这两个选项；使用者还可以点选第八章核酸引子设计59来分析引子形成dimer跟hairpinLoop的状况(图8.12)：图8.12分析Dimers&HairpinLoops的状况　在这个窗口中，实线数目的相关设定是在OligoAnalysis左边字段下方的StemLength项目（此数值关乎dimer跟hairpinLoop分析的严谨度，建议数值调高跟调低的结果都进行分析）。　NOTE：在做引子设计的时候尽量减少dimer和hairpinLoop的产生，因为dimer和hairpinLoop会降低使用者PCR的效率。　用户可以在分析的窗口窗口(图8.13)进行手动编辑，只要打入序列就可以分析使用者编辑的序列，但是请注意不可以有空格存在：图8.13在右边字段直接输入序列，分析输入的序列VectorNTI教育训练手册60　使用者也可以把现有的引子序列，利用鼠标复制贴上的功能将序列贴进来分析。分析的结果可以点选SaveResults储存，在此建议引子设计完成后，可以在分析的窗口进行引子序列的修饰，让使用者的引子更接近所需要的条件以及降低dimer跟hairpinLoop形成的可能性。　使用者也可以在一开始分析时，就把引子的设定条件做更细部的修订，在一开始设定的字段中后面还有很多选项(图8.14)：图8.14在一开始的分析时，做细部的字段　使用者可以根据自身的需求去设定这些项目，在引子条件设定完成后，可以按左下方的储存，之后若要在相同条件下设计引子时，只要按下就可以叫出预设的条件。AmplifySelection：此功能和FindPCRPrimers几乎一样，差别只是在于引子的设计位置会落在用户所选择序列范围端点跟端点的前后片段：图8.15AmplifySelection的设定　这个窗口(图8.15)下使用者想要夹400bp到800bp的片段，引子的设计落点会在这个范围前后两端，在Before跟After的选项用户可以把引子的分析点从端点的前后推进来进行分析（也可以不用设定，这样子引子只会落在分析范围的端点内），程序会分析出最佳的引子落点（大约涵盖在端点序列前后部份），其他操作方式和FindPCRPrimers是相同的(图8.15)。第八章核酸引子设计61图8.16夹400bp-800bp的片段分析斑馬魚海大基因1120bp正股引子落點反股引子落點欲範圍PCRAmplifyFeatures：此功能和FindPCRPrimers也是几乎一样，但是分析的范围设定在使用者有画在图谱上面Features的部分，注意要执行此功能时，用户事先画好的Features名称必须要和提供的名称一样才能执行。此功能操作接口和FindPCRPrimers一样，只差了一个Features的选项(图8.17)：图8.17AmplifyFeatures的设定　用户只要按下Add的按钮把用户画在图形上的Features加进去，再按下确定就可以分析出Features的引子序列了(图8.18)：图8.18使用AmplifyFeatures分析的结果VectorNTI教育训练手册62PCRusingExistingOligos：也和FindPCRPrimers功能几乎相同，差异的地方只是在于在中央间出现SensePrimers和AntisensePrimers选项，用户可以把储存的引子档案加入到设计的窗口(图8.19)中：图8.19将储存的引子档案加入设计　其他操作功能和FindPCRPrimers都是一样的。LongPCR：这项功能将在分析genomicDNA再说明。MultiplexPCRList：和AddtoOligoList功能差不多，只是直接把欲分析引子的序列加入暂存窗口内进行引子分析的功能(图8.20)：图8.20使用MultiplexPCRList分析的结果第八章核酸引子设计63AlignmentPCRList：此功能将在多重序列比对的部分再进行说明。SequencingPrimers：这项功能可以帮用户设计定序时所需的引子，在窗口(图8.21)中设定想要设计的条件：图8.21帮助使用者设计定序时所需之引子设好条件之后只要按OK就会显示引子数据，后续操作方式和FindPCRPrimers相同：图8.22利用SequencingPrimers分析的结果HybridizationProbes：此功能适用于设计核酸探针(图8.23)，能够用在南方墨点、北方墨点及定位杂交等实验探针设计：VectorNTI教育训练手册64图8.23HybridizationProbes设定，可设计核酸探针设定好条件后按下OK就会显示探针数据，后续操作方式和FindPCRPrimers相同：图8.24使用HybridizationProbes，显示探针数据NOTE：引子设计的条件和注意事项请参考相关的设定说明。设计引子时多尝试不同的条件配合NTI软件进行分析，如此用户较有机会得到最佳的引子。