有机酸衣康酸论文

土曲霉发酵生产衣康酸的工艺进展哈尔滨商业大学食品工程学院生物工程（中外合作）三班汤柱150000摘要:由于衣康酸具有特殊的化学结构，决定了他具有十分活泼的化学性质，是一种应用前景十分广阔的化学合成中间体。本文从土曲霉发酵生产衣康酸的影响因素、选育高产衣康酸菌株的方法以及发酵工艺优化方面做简要综述。关键字衣康酸发酵高产菌株工艺优化一．衣康酸简介1.衣康酸的发展衣康酸（Itaconicacid)又称2-甲基一丁二酸、亚甲基琥珀酸，它可以和其他分子发生加成聚合等化学反应，其酯类是制造合合成纤维、塑料、橡胶、表面活性剂和高分子成树脂鳌合剂等的添加剂和单体原料，广泛用于造纸、化妆、医药、化工、农业等领域。早在1836年学者们就通过蒸馏分解柠檬酸得到衣康酸，1929年日本学者发现能利用糖类生产衣康酸的微生物并命名为衣康酸曲霉（Asp.itaconicus）。此后Kinoshita分别于1929年、1931年、1932年报道了有关衣康酸发酵的研究情况，1939年，Calam,C.T等人发现土曲霉（Asp.terreus）也具有利用糖类生产衣康酸的能力，并系统地研究了以葡萄糖为原料，土曲霉发酵生产衣康酸的过程。衣康酸的生产除了利用微生物发酵法生产外，还可以通过化学合成法来获得，但与微生物发酵法相比，化学法成本过高。目前国内外大多以发酵法生产衣康酸。2.理化性质衣康酸是一种不饱和二元酸，分子式为C5H6O4，分子量为130.1。白色粉末状结晶，晶体呈八面体或正交双锥形，结晶产品不易吸潮，即使在高温条件下也不结块，在真空条件下加热升华，易溶于水。衣康酸有两个结构类似、化学性质相近的同分异构体，即柠康酸（顺式甲基丁烯二酸）和中康酸（反式甲基丁烯二酸），衣康酸在酸性、中性和弱碱性的条件下是稳定的，但在强碱条件下三种同分异构体可以相互转化。二．土曲霉发酵产衣康酸影响因素1.衣康酸发酵原料以糖类为发酵原料，补充适当的氮源和无机盐，控制适宜的温度条件，利用衣康酸生产菌种转化葡萄糖生成衣康酸，发酵液经除杂、提取、精致等工序制备成品衣康酸。由于衣康酸发酵菌株分泌糖化酶的能力缺乏或处于低水平，不能直接利用淀粉等大分子碳水化合物，通常将其预处理为菌株能利用的葡萄糖、蔗糖、糖蜜等。此外，国内外也有采用低脂水解唐，薯干粉，木薯粉，低脂玉米粉等碳源，所采用原料不同主要差别是原料的预处理阶段，而衣康酸发酵阶段是基本相同的。2.碳源、氮源、磷源影响在众多学者的实验研究结论得出土曲霉发酵生产衣康酸的主要碳源为葡萄糖，氮源为硝酸铵。Rychtera等报道了磷元素在衣康酸发酵长菌及产酸期的影响，指出菌体的最终浓度与PH值关系不大，而与磷的浓度有关，并指出PH值对磷及葡萄糖的呼吸速率有关。因此在考察磷源的同时，应综合考虑到磷元素的浓度。在学者通过正交实验考察了对土曲霉TN-474硝酸铵、玉米浆干粉和磷酸二氢钾三个因素对衣康酸发酵的影响。从正交结果看出玉米浆对衣康酸发酵的影响最大，而且不仅影响衣康酸产率，还影响生物量。在不添加玉米浆干粉时生物量较低，还原糖偏高；添加量过高，菌体生长旺盛，生物量增加，葡萄糖过多的消耗在菌体生长上，同时，由于生物量的加大，是培养基的粘度增大，影响发酵过程中基质的传递及溶氧水平，导致产量下降。因此合适的玉米浆浓度为0.2g/L。其次是磷酸二氢钾，主要是核酸的组成成分和能量传递物质三磷酸腺苷的成分，的合适用量为0.05g/L，最后是硝酸铵，是衣康酸发酵过程的主要碳源，能有效促进菌体的生长，合适用量为3g/L。3.温度、PH值的影响发酵过程中培养基的PH是微生物在一定环境条件下代谢的综合指标，PH的变化引起酶活力的改变，影响菌体对基质的利用速度和细胞的结构，从而影响菌体生长；除影响菌体生长外，PH还会影响细胞原生质膜的变化，影响带电性，从而影响营养物质的吸收和代谢产物外排，因此PH对微生物的生长和产物的合成有着重大的影响，是发酵过程中的重要控制参数之一。在土曲霉发酵生产衣康酸一般会采用硝酸调节培养基的PH。在一些研究中可以得出土曲霉的耐酸能力很强，在PH为1.5时也能生长，在PH为2.0左右产酸能力达到最高，当PH大于3.0时产酸能力就有大幅下降，主要是因为PH升高有利于菌球的形成，使培养基中的基质传递受到阻碍。因为微生物菌体生长和产物合成是在不同酶催化下进行的，温度是保证酶活性的重要条件，因此，合适的环境温度是保证衣康酸发酵正常进行的重要条件之一，从动力学看，温度的升高，反应速度加快，生产起提前，但酶容易受热而失去活性，在温度升高到一定程度时，酶活性随之降低。温度还可以通过改变发酵液的物理性质如温度可以改变基质和氧在发酵液中的溶解和传递，来间接影响菌体的产物合成。在学者对土曲霉发酵的实验中得到，在温度为31--37℃之间，衣康酸的产量最大，因不同发酵生产所用菌株和培养基以及外界因素影响，实际实验中最是温度略有差异。4.其他影响因素在发酵过程中还有一些其他主要影响因素，如：种龄、接种量、金属离子。种子的质量对发酵有重要影响，一般实验中均采取对数期菌体进行接种，但是采用对数期不同时间的菌体进行接种所得的产酸量也有很大差别。接种量的大小决定于生产菌种在发酵中生长繁殖的速度。采用较大的接种量可以缩短菌丝到达高峰的时间，使产物的形成提前到来，但如果接种量过多，可能会引起菌丝生长过快，培养液粘度增加，造成溶氧不足，从而影响产物合成。根据有关实验测得接种量在10%--20%的比例最佳。金属离子，尤其是二价金属离子对发酵过程也有不同程度影响。如一些学者研究得出：二价镁离子（MgSO4.7H2O）对土曲霉的生长和产酸均有促进作用，同时也能提高菌体的耐酸能力，另有报道称，土曲霉的衣康酸发酵需要一定浓度的SO42-。对二价铜离子（CuSO4.5H2O）的研究表明，微量的二价铜离子能促进衣康酸产量的提高。有报道称二价锌离子（ZnSO4.7H2O)在菌体生长期有利于孢子的萌发和加速生长。三．高产衣康酸菌株的选育1.原生质体融合法Kirimura等以Aspergillusterreus和A.usamii为亲本进行原生质体融合子F-112，其利用淀粉产衣康酸的最高产酸率达35.9mg/mL。也有学者通过黑曲霉与栖土曲霉原生质体融合，是两者的遗传物质发生重组，以获得直接利用生淀粉生产衣康酸的融合菌株，并达到节能和降低衣康酸生产成本的目的。实验中两亲本的原生质体对苯菌灵的抗性存在差异，用苯菌灵对黑曲霉进行诱导培育，使其抗药性进一步提高，挑选抗性稳定且发酵葡萄糖酶活高的作为亲本，采用紫外线灭火黑曲霉原生质体，然后与等量的栖土曲霉原生质体混合，以PEG6000为促溶剂进行培养，然后采用双层平板法和直接涂布法检出融合子，通过与亲本对照培养可初步检出异核体,将异核体菌落的孢子转接到含0.1%樟脑的TRM培养基上，通过传代培养可检出杂合二倍体。对融合子和两亲本的发酵性能进行检测，融合子淀粉为碳源的衣康酸产率达到40.9mg/mL，对供给淀粉的转化率为40.9%,是亲本栖土曲霉以蔗糖为碳源的康酸产率(65mg/mL)的62%；产葡萄糖淀粉酶活力为17.3U/mL,是亲本黑曲霉以淀粉为碳源产酶活力(23.2U/mL)的64%。从而也得出采用黑曲霉与栖土曲霉原生质体融合获得直接利用生淀粉生产衣康酸的融合菌株的方法可行，但是产衣康酸发酵条件的优化有待进一步研究。2.离子注入法有学者采用低聚氮离子束注入衣康酸生产菌株土曲霉ZJB-04173，获得一株衣康酸产量提高的突变株HA90，该茵株在出发培养基37℃发酵5d，产酸量达到78g/L，比出发菌株提高了39.2%。主要操作是通过低能氮离子对土曲霉进行处理，菌种的存活率随照射剂量的增多菌种存活率逐步降低然后升高在降低。选取三个常用诱变剂量对菌种进行摇瓶发酵，可以看出诱变后的菌株以负突变居多，随着诱变剂量得增加，正突变率也逐渐降低。应用低能氮离子注入技术诱变衣康酸生产菌株，经过大量筛选获得较高产衣康酸突变株，实验还采用响应面法对突变株的发酵培养基进行了优化，确定了葡萄糖、硝酸铵和硫酸镁三个影响发酵的主要因素的最适浓度进行了确定，在优化后的培养基中进行发酵，产酸量最高达到84g/L,比出发茵株提高了50%。3.耐高温菌株的筛选以生产使用菌种土曲酶NLYT234为出发菌株，经紫外线、高温、氯化锂诱变处理和形态筛选法、高酸、高渗透压平板筛选法、摇瓶初筛、摇瓶复筛最终得一支性能稳定的衣康酸高产突变株土曲霉NLYT-2-801,40℃-43℃摇瓶72h，衣康酸产量89.6g/L-92.4g/L，糖酸转化率63.18%-67.83%。经300m3发酵罐生产验证，菌种诱变后酸度较以前提高31.1%，转化率提高6%以上，大大降低了生产成本。经菌种传代和保藏实验证明突变株NLTY-2-801突变性状稳定，现已在年产万吨衣康酸项目上应用。不过，本菌种的性能还有待进一步提高。四．衣康酸发酵工艺的优化1.农用废弃物发酵产衣康酸通常在工业和实验中采用发酵法生产衣康酸所用原料为葡萄糖和蔗糖，有实验研究采用农用废弃物麸皮、玉米芯为出发培养基固态发酵生产衣康酸也取得了一定成果。实验通过固态发酵，在自然PH值36℃下，以麸皮、玉米芯为出发培养基，发现土曲霉T8138菌株是生产衣康酸的优良菌株，适合多种原料的衣康酸生产。实验表明，以麸皮、玉米芯为出发培养基的固态发酵生产衣康酸切实可行，麸皮，玉米芯含有丰富的营养物质，属于农用废弃物，利用其发酵生产衣康酸价格低廉，来源充足。葡萄糖、硝酸铵是土曲霉发酵的最适碳源和最适氮源。硫酸镁、磷酸二氢钾等无机盐对发酵产酸有促进作用。实验还通过正交实验考察土曲霉固态发酵产衣康酸的动力学特征，对发酵培养基进行了优化，最终发酵产得衣康酸达60%-67%。2.衣康酸发酵动力学研究发酵行业虽然在中国很早就有，如酒、酱等，但是很大程度上人们在实际生产中都是依据经验在操作，发酵动力学的研究为发酵工程的进展提供了理论基础。目前目前对发酵法生产衣康酸的研究主要集中于菌种选育，如利用廉价底物糖蜜、淀粉、木屑、稻草等农副产品生产衣康酸，及利用固定化士曲霉进行分批和重复分批发酵，以及气升罐较搅拌罐在产酸速率及能耗方面的研究等，而对衣康酸发酵动力学研究较少。研究学者对气升罐和搅拌罐发酵遵行了研究，并在此基础上建立了衣康酸分批发酵动力学模型，动力学模型的建立对了解菌体生长、产物形成机制、改进操作工艺都有重要意义。微生物生长在不同的物理和化学环境中，它们的生长和其他生理活性实际上是对其物理化学环境的一种响应。发酵动力学是对微生物生长、营养消耗和产物形成的数学描述。实验中分别考察了不同初糖浓度下衣康酸的生长情况，溶解氧、培养方式对发酵的影响，建立衣康酸发酵动力学机制分析得出如下结论：（1）土曲霉可耐较高的渗透压，衣康酸发酵可在较高的初糖浓度下进行，以获得较高的酸浓度，，但初糖浓度高于16%，仍有较明显的底物抑制现象。在分批发酵中，初糖浓度在10%-15%较为适宜。（2）衣康酸发酵过程中保持适当的溶解氧水平，对于提高转化率、缩短发酵时间有重要作用。（3）对衣康酸的发酵，在适宜的操作条件下，气升罐较搅拌罐结果好。（4）建立的发酵动力学模型模拟的结果与实验结果吻合较好，可对发酵过程进行预测。（5）衣康酸合成为非生长机制为主的混合型动力学机制。衣康酸台成贯穿整个发酵过程中。五．总结本文对土曲霉发酵产衣康酸过程进行了简要总结，得出衣康酸生产过程最适碳源为葡萄糖，最适氮源为硝酸铵，同时磷源、种子性质和金属离子对代谢也有较大影响。发酵最适温度在31℃--37℃，PH值在2.0左右产酸最大。实验室阶段已经采取通过原生质体融合法、离子注入法和耐高温菌株筛选获得高产衣康酸的菌株，并且有些应经工业化。此外，还对衣康酸代谢工程进展做了简要介绍，如，在原料方面农用废弃物的应用，一些研究还涉及到淀粉水解程度对衣康酸生产的考察和液态发酵过程条件的控制，发酵动力学的研究在生产中广泛应用将大大提高生产效益。参考文献：[1]赖霞.土曲霉发酵生产衣康酸的工艺研究.南昌大学.2008.12[2]汤庆莉孙慧.衣康酸生产工艺