抗肿瘤药物体内筛选试验标准操作规程(SOP)

抗肿瘤药物体内筛选标准操作规程概述：抗肿瘤药物是指能够直接杀伤或抑制肿瘤细胞生长或增殖的一类药物，作用机制包括抑制肿瘤细胞核酸或蛋白质的合成、干扰大分子物质代谢、干扰微管系统、抑制拓扑异构酶等。本操作规程包括与抗肿瘤药物申请临床试验和申请上市有关的非临床有效性和安全性研究的内容，其中着力强调非临床有效性和安全性之间的关联性，以及非临床研究和临床试验之间的关联性。旨在一方面为抗肿瘤药物的非临床研究提供技术参考；另一方面，通过技术要求引导科学有序的研发过程，使国内此类药物的研发更趋规范和合理。本操作规程仅代表目前对抗肿瘤药物非临床研究的一般性认识。具体药物的非临床研究应在本指导原则的基础上，根据药物的自身特点制订研究方案。研究目的：建立一套包括抗肿瘤药物体内作用的药效学研究和评价体系及相应的标准操作规程以及抗肿瘤药物安全性和作用新机制的研究。①有效性研究抗肿瘤药物有效性研究的目的主要在于探索受试物的作用机制、作用强度、抗瘤谱等，为之后的安全性评价以及临床试验中适应症、给药方案的选择提参考信息。②安全性评价安全性评价的目的主要包括：（1）估算I期临床试验的起始剂量；（2）预测药物的毒性靶器官或靶组织；（3）预测药物毒性的性质、程度和可逆性；（4）为临床试验方案的制订提供参考。研究计划：(a)小鼠急性毒性测试按照急性毒性测试的常规方法，选用昆明种小鼠，通过腹腔注射方式给药，测定体外抗肿瘤活性突出的化合物的半数致死量（LD50），参考给药小鼠体重变化情况，评价化合物的急性毒性，并确定小鼠体内抗肿瘤活性测试的给药剂量。(b)小鼠体内抗肿瘤活性测试根据动物体内抗肿瘤活性测试的标准方法，选用昆明种小鼠，皮下接种肉瘤S180或肺癌H22瘤株，选择体外活性突出且急性毒性较低的化合物，设定合适的剂量通过腹腔注射方式给药，以临床常用抗肿瘤药物环磷酰胺作为阳性对照药物，测定肿瘤生长抑制作为体内活性评价指标。(c)专利保护范围内的化合物的继续合成申请保护范围较大的专利，合成部分可能具有良好活性的新的化合物，拓展研究范围，发现活性更强的化合物，并申请新的发明专利。并可针对具体化合物申请从属专利，延长高活性化合物的保护期限。（d）体外抗肿瘤活性的广泛筛选采用MTT法或台盼蓝染色法，测定化合物对多种人肿瘤细胞株的增殖抑制活性，确定化合物在不同瘤株间抗肿瘤活性的选择性，为裸鼠模型实验提供依据。（e）抗肿瘤作用机理的深入研究根据抗肿瘤（f）人癌裸鼠移植瘤模型实验活性化合物作用机理特征，选用微管蛋白聚合等实验从分子水平确认化合物的作用机理；利用人脐静脉血管内皮细胞探讨化合物对内皮细胞骨架的影响及诱导凋亡的途经，从细胞水平上阐明化合物的作用机理。根据抗肿瘤新药审批办法的要求，采用裸小鼠皮下接种模型和/或原位移植瘤模型，以相对肿瘤增值率和生存时间为指标，确定化合物的抗肿瘤活性。（g）动物体内药物代谢动力学实验选择在人癌裸鼠移植瘤模型实验中活性良好的化合物，开展动物体内药物代谢动力学实验，考查化合物的吸收、分布、代谢、排泄性质。（h）动物亚急性，长毒实验根据抗肿瘤新药审批办法的要求，测定动物亚急性、长毒性质，进行药物安全性评价。基本方法：①小白鼠的灌胃法以左手捉持小白鼠，使腹部朝上，右手持灌胃器。灌胃器先从小白鼠口角插入口腔内，然后沿着上颚壁轻轻插入食管，稍感有阻力时（大约灌胃管插入1/2，相当于食管过膈肌的部位），即可推进注射器，进行灌胃（图1）。若注射器推进困难，应重插。若灌胃器误插入气管给药，可致小白鼠死亡。注药后轻轻抽出灌胃管。此法1次给药量为0.01-0.03ml/g。图1.小白鼠的捉持及其灌胃法②小白鼠皮下注射法通常在其背部皮下注射。将其皮肤拉起，注射针刺入皮下，把针尖轻轻左右摆动，易摆动表示已刺入皮下，然后注射药液。拔针时，以手指捏住针刺部位，以防止药液外漏（图2）。该法对小白鼠的1次注射药量为0.01-0.03ml/g。图2.小白鼠的皮下注射法③小白鼠静脉注射法一般采用尾静脉注射法。事先将小白鼠或大白鼠置于固定的筒内或铁丝罩内，或扣于烧杯内，使其尾巴露出（图3）。将尾置于45-50℃的温水中浸泡或用75%的酒精棉球擦之，以使血管扩张。然后，选择尾巴左、右两侧静脉进行注射。注射时若出现隆起的白色皮丘，说明药物未注入血管。这时，注射器应向尾根部位移动，重新注射。该法对小白鼠的1次注射量为0.005-0.01ml/g。图3小白鼠尾静脉注射法④小白鼠腹腔注射法以左手捉持小白鼠，让其腹部向上，右手将注射器针头刺入皮肤，刺入部位距离下腹部腹白线稍向左或右的位置（图4）。向前推进注射器3-5mm,，接着使注射针与腹部皮肤面呈45°刺入小白鼠的腹肌，继续向前刺入，针头通过腹肌进入腹腔后阻力消失，这时即可慢慢注入药液。对小白鼠的1次注射量为0.01-0.02ml/g。图4.小鼠腹腔注射法⑤实验动物的标记实验用较大动物如兔、猫、犬等可用特制的号码牌固定于耳上。白色家兔和小鼠、大鼠,可用黄色苦味酸（3%-5%）涂于毛上标号。其编号方法无统一规定，以下方法可供参考。如给小鼠标记1-10号，可将小鼠背部分前肢、腰部、后肢，按左、中、右分为九个区,从右到左标记1-9号，第10号不标记（图5a）。如给小鼠标记1-20号，则（图b）。1号———右前肢11号———腰部及右前肢2号———左前肢12号———腰部及左前肢3号———左后肢13号———腰部及左后肢4号———右后肢14号———腰部及右后肢5号———头部15号———腰部及头部6号———头部及右前肢16号———腰、头部及右前肢7号———头部及左前肢17号———腰、头部及左前肢8号———头部及左后肢18号———腰、头部及左后肢9号———头部及右后肢19号———腰、头部及右后肢10号———腰部（背中间20号———尾根部图5.小鼠、大鼠皮毛标记编号法(a)小鼠急性毒性测试目的：测定LD50了解受试物的毒性强度、性质和可能的靶器官，为进一步进行毒性试验的剂量和毒性观察指标的选择提供依据，并根据LD50进行毒性分级。结果判定：①如LD50小于人的可能摄入量的100倍，则放弃该受试物。如LD50大于或等于100倍者，则可考虑进入下一阶段毒理学试验。②如动物未出现死亡的剂量大于或等于10g/kgBW（涵盖人体推荐量的100倍），则可进入下一阶段毒理学试验。③对人的可能摄入量较大和其它一些特殊原料，按最大耐受量法给予最大剂量动物未出现死亡，也可进入下一阶段毒理学试验。范围：本方法规定了急性毒性试验的基本技术要求。术语和定义：下列术语和定义适用于本方法。①半数致死量（LD50）是经口给予受试物后，预期能够引起动物死亡率为50%的单一受试物剂量，该剂量为经过统计得出的估计值。其单位是每公斤体重所摄入受试物质的毫克数、克数或毫升数，即mg/kgBW、g/kgBW、mL/kgBW。②最大耐受剂量法(MTD)：用最大使用浓度和最大灌胃容量给予20只动物后，连续观察7-14天，未见任何动物死亡，则MTD大于**g/kgBW。原理经口一次性给予或24h内多次给予受试物后，在短时间内观察动物所产生的毒性反应，包括致死的和非致死的指标参数，致死剂量通常用半数致死剂量LD50来表示。实验动物一般均分别用两种性别的成年小鼠或大鼠。小鼠体重为18-22g，大鼠体重为180-220g。如对受试物的毒性已有所了解，还应选择对其敏感的动物进行试验，如对黄曲霉素选择雏鸭。动物购买后适应环境3-5天。操作步骤①受试物的处理：受试物应溶解或悬浮于适宜的介质中。一般采用水或食用植物油作溶剂，可以考虑用羧甲基纤维素、明胶、淀粉等配成混悬液；不能配制成混悬液时，可配制成其它形式（如糊状物等）。必要时可采用二甲基亚砜。但不能采用具有明显毒性的有机化学溶剂。如采用有毒性的溶剂应单设溶剂对照组观察。②受试物的给予途径：经口。试验前空腹：动物应隔夜空腹（一般禁食16h左右，不限制饮水）。容量：各剂量组的灌胃容量相同（ml/kgBW），小鼠常用容量为20mL/kgBW；大鼠常用容量为10ml/kgBW。方式：一般一次性给予受试物。也可一日内多次给予（每次间隔4-6h，24内不超过3次，尽可能达到最大剂量，合并作为一次剂量计算）。常用的急性毒性试验设计方法霍恩氏（Horn）法预试验：可根据受试物的性质和已知资料，选用下述方法：一般多采用0.1、1和10g/kgBW的剂量，各以2-3只动物预试。根据24内死亡情况，估计LD50的可能范围，确定正式试验的剂量。也可简单地采用一个剂量，如215mg/kgBW，用5只动物预试。观察24h内动物的中毒表现。如症状严重，估计多数动物可能死亡，即可采用低于215mg/kgBW的剂量系列，反之症状较轻，则可采用高于此剂量的剂量系列。如有相应的文献资料时可不进行预试。动物数：一般每组用5只。常用剂量系列：1.002.15×10tt=0,±1,±2,±34.64因为剂量间距较1.00/3.16×10tt=0,±1,±2,±3为小，所以结果较为精确。一般试验时，可根据上述剂量系列设计)个组，即较原来的方法在最低剂量组以下或最高剂量组以上各增设一组，这样在查表时容易得出结果。正式试验：将动物在实验动物房饲养观察3-5天，使其适应环境，证明其确系健康动物后，进行随机分组。给予受试物后一般观察7或14天，若给予后的第4天继续有死亡时，需观察14天，必要时延长到28天。记录死亡数，查表求得LD50，并记录死亡时间及中毒表现等。该方法的优缺点：优点是简单易行，节省动物；缺点是所得LD50的可信限范围较大，不够精确。但经多年来的实际应用与验证，同一受试物与寇氏法所得结果极为相近。因此对其测定的结果应认为是可信与有效的。最大耐受量试验：适宜条件：有关资料显示毒性极小的或未显示毒性的受试物，给予动物最大使用浓度和最大灌胃容量的受试物时，仍不出现死亡。动物：至少雌、雄各10只。剂量：受试物最大使用浓度和灌胃容量（一个剂量组）。方法：动物购买后观察3-5天，给予最大使用浓度和最大灌胃容量的受试物（一日内1次或多次给予，一日内最多不超过3次），连续观察7-14天，动物不出现死亡，则认为受试物对某种动物的经口急性毒性剂量大于某一数值（g/kgBW）。最大灌胃容量小鼠为20mL/kgBW，大鼠为20mL/kgBW。(b)小鼠体内抗肿瘤活性测试体内试验用于确认受试物对特定类型肿瘤细胞的杀伤或抑制作用，探索受试物产生药效作用的给药剂量、途径、频率、周期等。体内试验通常采用动物肿瘤移植模型和人癌移植模型。由于动物肿瘤移植模型与临床疗效之间的相关性不强，仅可用于侯选化合物的初步筛选。通常情况下，以人癌移植模型试验结果来评价抗肿瘤药物的有效性。1、模型建立细胞毒类抗肿瘤药物临床前体内试验一般至少应选用6种人癌移植瘤模型，其中应包括II期临床试验中拟筛选的肿瘤组织类型。模型的建立和使用应注意：移植瘤复苏后一般应传2-3代后再用于体内抗肿瘤试验；为了保持移植瘤的生物学特性和遗传特性，复苏后移植瘤体内传代应少于15-20代。2、试验设计肿瘤移植部位主要在皮下，也包括腹腔、肾囊下和原位等。通常待移植肿瘤生长至100-300mm3后将动物随机分组给药。一般包括高、中、低3个剂量的治疗组、阳性对照组和阴性对照组。治疗组受试物剂量的选择应能够体现出药物的量效关系，高剂量不宜超过受试物的最大耐受剂量。应根据受试物的药动学特点和毒性反应等确定给药频率和周期；给药途径应尽量与推荐临床用药的途径相同。阳性对照药一般应满足以下条件：（1）与受试物作用机制相同或相近；（2）对移植肿瘤敏感；（3）临床广泛应用且疗效确切。阳性对照药的给药方案应能够体现出药物的最佳治疗作用，其剂量一般不宜超过最大耐受剂量。阴性对照组给予相应的溶剂。3、检测指标推荐使用测量瘤径的方法，动态观察受试物的抗肿瘤效应。肿瘤直径的测量次数根据移植瘤的生长情况而定，一般为每周2-3次。在试验中还应该观测与药物安全性有关的指标，如动物体重增长和死亡率，将治疗组的这些数据与标准治疗对照组进行比较，对于判断药物的安全性和开发前景具有重要的意义。试验中应记录检测指