一氧化氮的检测

脑内神经递质的检测——一氧化氮脑内神经递质的类型1胆碱类乙酰胆碱2单胺类(1)儿茶酚胺a去甲肾上腺素b多巴胺c肾上腺素(2)吲哚胺5-羟色胺3氨基酸类(1)抑制性氨基酸类：γ-氨基丁酸，甘氨酸（2）兴奋性氨基酸类：谷氨酸，天冬氨酸4多肽类，神经肽类阿片肽，其他神经肽5其他神经递质NO，前列腺素，组胺，嘌呤类一氧化氮的产生血管内皮细胞和神经细胞是NO的生成细胞。NO的生成由一氧化氮合酶（NOS）催化，以L-精氨酸为底物，以NADPH作为电子供体，生成NO和L-瓜氨酸。亚硝酸盐的还原也是体内部分组织生成一氧化氮的一种方式。一氧化氮在神经系统中的作用生理功能：低浓度时，信息传递。参与学习、记忆，并且具有调节脑血流的作用。在中枢神经系统突触后神经末梢,谷氨酸等兴奋性氨基酸通过N-甲基-D-天冬氨酸受体引发钙离子内流,激活cNOS产生NO,继而通过cGMP等途径传递信号。神经毒性：高浓度时，脑缺血诱导表达iNOS,生成大量NO,损伤神经系统。参与一些神经退行性疾病的发生发展一氧化氮的性质易逸性、不稳定性NO是无色气体，含一对未配对电子的自由基，十分活跃不安定，生命周期很短，半衰期约3-5秒，只活跃10秒就会氧化成亚硝酸盐(NO2－)和硝酸盐(NO3－)检测方法荧光分析法化学发光法--鲁米诺法电化学传感器光学传感器--光学生物传感器荧光分析法原理：NO+N-乙酰半胱氨酸(NAC)硝基N-乙酰半胱氨酸(NACNO)NACNO在334nm有一吸收峰,波长范围与硫酸喹啉（荧光物质）的激发波长相重叠。NACNO起到内滤过效应,与硫酸奎宁“竞争性”吸收334nm波长的能量,使硫酸奎宁的荧光强度减弱,由NO生成的NACNO越多,内滤过效应越强。所以，测定硫酸奎宁荧光强度的改变,可反映NO的量。注意：脑内产生的NO经代谢后主要以较为稳定的亚硝酸盐或硝酸盐的形式存在,在酸性条件下,亚硝酸盐形成的亚硝酸不稳定,可释放出NO。因此,NO的测定需在酸性条件下。荧光分析法试剂：N-乙酰半胱氨酸,硫酸奎宁（分析纯）亚硝酸钠，HCl和磷酸盐缓冲液(pH7.4)仪器：岛津UV-260紫外分光光度计岛津RF-5000荧光光度计荧光分析法1、NACNO的制备及波峰扫描2、观察NACNO对硫酸奎宁的内滤过效应3、NO的标准曲线（以NACNO的浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标）4、脑组织NO的测定（制作脑匀浆）根据NO的标准曲线计算NO的量荧光分析法评价：特异性高、操作简单、稳定NO与N-乙酰半胱氨酸的反应特异性高,保证了测定的特异性,最低可测定10-8mol·L-1水平硫酸奎宁是一种非常稳定的荧光物质,脑匀浆的浓度对硫酸奎宁的荧光强度几乎无影响。采用以荧光强度的变化来计算NO的产生量,消除了体系中各物质对荧光强度的背景作用。化学发光法--鲁米诺法原理：利用过氧化氢氧化NO生成的过亚硝酸根激发化学发光试剂鲁米诺，激发态的鲁米诺回到基态时会发出光学信号，以化学发光强度作为一氧化氮的定量指标。东京大学的一个课题组曾将鲁米诺-过氧化氢化学发光法与微透析技术结合用于实时测定活体大鼠脑部的一氧化氮，检测限可达1nmol-1。化学发光法--鲁米诺法评价：反应灵敏度较高，响应时间短。鲁米诺可以与多种物质发生氧化反应，方法的选择性和专属性受到影响。鲁米诺法与微透析等取样技术联用，虽然可以提高反应的选择性，却会造成测定时间延长，灵敏度下降等问题。电化学传感器原理：利用NO的氧化还原性，使其在电极上释放电子最终被氧化为硝酸根离子，由反应发生时电化学信号的变化来反映含量。是公认的直接测定NO的方法电化学传感器Barbosa等用碳纤维微电极实时检测麻醉大鼠脑部NO的变化。1、在碳纤维电极表面修饰全氟磺酸离子交换膜和邻苯二胺膜，选择性透过NO，阻止阴离子和大分子物质(如抗坏血酸、DA、NA等)透过。2、将微电极与微量吸管黏结后，立体定位插入大鼠脑部，测定N-甲基-D-天门冬氨酸激活大脑海马组织NOS产生的NO。电化学传感器评价：实现了原位活体检测NO的目标检测限可达nmol级，快速、准确、灵敏度高、仪器简便和成本较低，可以研究NO在生物体内的代谢动力学。光学传感器--光学生物传感器原理：NO可以和生物体内的cGMPase中的亚铁血红素发生特异性结合，激活cGMPase,将GTP转变为cGMP，进而由cGMP激活cGMP依赖的蛋白激酶，引发下游的信号级联反应，产生生物学效应。以光学信号强度(荧光或化学发光强度)作为NO定量的指标，能够快速、准确、实时的反映一氧化氮含量的变化。光学传感器--光学生物传感器Sato等设计了NO的生物传感器—NOA-I。首先在cGMPase上连接荧光探针，该探针由环磷酸鸟苷依赖的蛋白激酶,黄色荧光蛋白和青色荧光蛋白组成。血管内皮细胞转染该传感器后，细胞内的NO与NOA-1结合产生的cGMP，激活产生荧光共振能量转移(FRET)信号，检测到该细胞产生了1nmol·L-1的NO。该小组随后又成功制备了NO生物传感器--Piccell细胞株。稳定表达特异性检测cGMP的荧光探针，利用探针产生的FRET信号考察神经元细胞释放NO的动力学过程，检测限低达20pmol·L-1。光学传感器--光学生物传感器评价优点：检测灵敏度和特异性高，可逆性和重现性，适于进行细胞动力学研究；缺点：制备过程繁琐，需要专业技术人员才能完成，受到了一定程度的限制。前景与展望多种NO分析方法已经被建立并逐步应用于体外NO水溶液、活细胞和组织成像以及原位活体NO检测，灵敏度可达到纳摩尔级甚至更低水平，方法选择性和准确度也有显著提高，发展速度不容忽视。NO定量方法学和分析技术还有待于深入探索和研究，现有方法还不能完全准确地测定体内NO的含量及其释放动力学过程。谢谢！