流式细胞分析在临床血液学中的应用

流式细胞分析在临床血液学中的应用西南医院检验科黄君富1、白血病免疫分型FAB主要依据形态学和细胞化学进行分型。MIC方案在FAB方案基础上结合了免疫学和细胞遗传学。（M：形态学I：免疫学C：细胞遗传学）免疫分型与FAB的关系FAB分型受检查者的主观因素影响大，符合率有一定限制。免疫标志能够提供正常细胞在演变成恶性肿瘤过程中细胞基因及抗原标志发生变化的信息，而这种变化常常是细微的，以至于常规FAB方法不能分辨。免疫分型是MIC的重要组成部分，它是对FAB分型的补充。属于同一种FAB型的病例，可能具有不同的免疫表型。免疫表型在AML和ALL上与FAB的不一致并不减低免疫分型在白血病患者的应用价值，相反，免疫表型使我们对血液肿瘤细胞的生物学特征有了更深入和更精确的认识。免疫表型对肿瘤的诊断、治疗策略的制定、预后判断及肿瘤发病机制的研究都具有重要作用。免疫分型的两个阶段根据白血病细胞表达的系列相关抗原，确定其系列来源。如：淋系T/B、粒单系、红系、巨核系等。根据白血病细胞表达的系列分化其相关抗原进一步分型。如：早前B，前B，普通B…急性白血病的四大免疫类型单表型急性白血病表达某一个系列抗原为主的急性白血病双表型/双克隆急性白血病未分化型急性白血病急性白血病的免疫学系列分型类型系列积分B系T系粒单系巨核系红系1.单表型纯B-ALL20000纯T-ALL02000纯AML00200纯AML-M600≦2≦22纯AML-M700≦22≦2急性白血病的免疫学系列分型类型系列积分B系T系粒单系巨核系红系2.单表型为主My+B-ALL20≦200My+T-ALL02≦200Ly+AML≦2≦2222T+B-ALL2≦2000注:My+:髓系抗原阳性;Ly+:淋系抗原阳性急性白血病的免疫学系列分型类型系列积分B系T系粒单系巨核系红系3.双表型/双克隆型T/B22000T/M02200B/M202004.未分化型AUL≦2≦2≦2≦2≦2B细胞系ALL的免疫分型亚型CD19CD20HLA-DRCD10CyIgSmIgFAB分型早前B-ALL+—+———L1,L2前B-ALL+—/++++—L1普通B-ALL++/—++——L1,L2成熟B-ALL++++/——/++L3T细胞系ALL的免疫分型亚型CD7CD2TdTFAB分型早前T-ALL+—+L1,L2T-ALL+++L1,L2免疫分型的价值确定ALL的细胞类型（B细胞或T细胞）和ALL的分化阶段。鉴定AML的特征。对形态学上未分化的急性白血病有助于鉴定细胞类型。诊断一些少见类型的白血病。如：M6、M7、M0等。诊断双表型/混合细胞型急性白血病。鉴别诊断ALL伴有髓系抗原表达（My+）或AML伴有淋系抗原表达（Ly+）。鉴别急性白血病与其他造血系统和非造血系统恶性肿瘤。根据一些特殊的免疫表型特征诊断与某核型异常相关的亚型。如：M3/t(15;17);M2/t(8;21);M4Eo/inv(16)等。慢性白血病免疫分型慢性粒细胞性白血病主要用于急变期的分型（同急性白血病免疫分型）。慢性淋巴细胞性白血病除了鉴别是T还是B淋巴细胞型外，还用于与反应性淋巴细胞增多症的鉴别，以及与部分淋巴瘤的鉴别诊断。一些少见的白血病如：毛细胞白血病、浆细胞白血病、恶性组织细胞性白血病等的诊断与鉴别诊断。2、再生障碍性贫血的研究AA是一组由不同发病机制介导的骨髓造血功能障碍综合征，其发病机制复杂，目前尚未完全明了，但越来越多的临床和实验证据表明，免疫介导的造血抑制AA最常见的病理机制之一。而且，具有免疫表型异常（如：CD4/CD8倒置，CD8+、活化T细胞或TCRγδ异常增高等）的患者，临床表现相对严重，但免疫抑制治疗相对有较好的疗效。常用的淋巴细胞表面标志物淋巴细胞亚群●T细胞：CD3+、TCRγ/δCD4+(Th/Ti)CD8+(Ts/Tc)●B细胞：CD19+●NK细胞：CD3-CD16+CD56+淋巴细胞亚群细分：●T细胞：Ts：CD8+CD28-Tc：CD8+CD28+Th：CD4+CD29+Ti：CD4+CD45RA+●B细胞：B1：CD5+CD19-B2：CD5+CD19+活化淋巴细胞亚群：●活化总T细胞：CD3+/HLA—DR+●静止总T细胞：CD3+/HLA—DR-●活化CD4+细胞：CD4+/HLA—DR+●活化CD8+细胞：CD8+/HLA—DR+●活化诱导分子：CD69●白细胞介素2低亲和力受体：CD25CD25+/CD3+：活化T细胞CD25-/CD3+：静止T细胞根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同CD4+:Th1:CD4+IFNr+Th2:CD4+IL4+Th0:CD4+IFNr+IL4+CD8+:Tc1:CD8+IFNr+Tc2:CD8+IL4+Tc0:CD8+IFNr+IL4+Th1细胞：介导细胞免疫、细胞毒性T细胞的生长和活化、巨噬细胞的活化、介导迟发型过敏反应。其功能亢进将导致炎症慢性迁延，器官特异性自身免疫病，急性排异反应和接触性皮炎等的发病和免疫病理损伤。Th2细胞：介导体液免疫，促进B细胞的生长、活化和分化，是IgG1和IgE类抗体的转换因子，其功能亢进将导致特异性过敏反应，参与高IgE综合症和嗜酸性粒细胞增多症。Th1/Th2细胞平衡偏移多见于：感染症、自身免疫病、过敏症、排斥反应、免疫缺陷、肿瘤恶化等。检测Th1/Th2细胞平衡主要是分析疾病发生发展的状况，为临床调整Th1/Th2细胞平衡偏提供正确的治疗依据。3、血栓与止血血小板糖蛋白●血小板质膜糖蛋白GPⅠa：CDw49bGPⅢa：CD61GPⅠb：CD42bGPⅣ：CD36GPⅠc：CDw49fGPⅨ：CD42aGPⅡa：CD29GPⅡb：CD41GPⅡa'：CD31●血小板颗粒膜糖蛋白α颗粒：CD62P(GMP140、PADGEM)λ颗粒：溶酶体完整膜糖蛋白CD63溶酶体相关膜糖蛋白-1LAMP-1溶酶体相关膜糖蛋白-2LAMP-2活化血小板检测●CD62P，CD63●GPⅡb/Ⅲa复合物(CD41/61)●GPⅣ(CD36)●PAC-1●Thrombospondin●血小板内钙离子遗传性血小板功能缺陷性疾病诊断●巨血小板综合症(BSS)GPIb-Ⅸ(CD42a/CD42b)缺陷或缺乏●血小板无力症(CT)GPⅡb/Ⅲa(CD41/61)缺陷或缺乏●贮存池疾病-SPD下降4、CD34的绝对计数随着近年来外周血造血干细胞移植病例的日益增多，外周血造血干细胞的流式定量越来越成为一个突出的话题。如何准确地定量干细胞数量，什么是有效的质量控制成了各大实验室的话题。1989年，欧洲人创建了米兰方案，利用SS与CD34作双参数直方图，计算CD34阳性细胞数；同年，北欧人改进了米兰方案，加入了对照，称之米兰/北欧方案。1995年，血液病治疗及移植国际联合会(theInternationalSocietyofHematotherapyandGraftEngineering，ISHAGE)成立了干细胞绝对计数(Enumeration)小组，致力于寻求一种简单、快速、灵敏的流式细胞仪检测方法去定量外周血中的造血干细胞数量。这一方法必须是对于临床实验室中不同的流式细胞仪都有效，而且在不同的移植中心具有可比性。这一方案即在96年问世的ISHAGE方案，至今为止，其他各种方案改进均以此方案为基础。5、多药耐药（MDR）的研究白血病治疗的失败再很大程度上是由于白血病细胞对化疗药物产生了耐药。因此对白血病耐药机制的研究具有重要的意义。但是耐药的形成过程却很多。主要有几个方面：药物吸收减少、细胞解毒作用增强、靶分子改变、DNA损伤修复能力增强、细胞内药物溢出增多、细胞凋亡的抑制等。常见的流式检测项目：参与药物在细胞内外转运的蛋白：P-170、MRP、LRP、BCRP、MVP参与细胞解毒的酶：ALK、GST、GSH、MS抑制细胞凋亡的蛋白：bcl-2/bax、P53药物泵的功能检测：罗丹明123（R123）或柔红霉素6、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)是由于造血干细胞发生体细胞突变而引起的获得性溶血性贫血,典型病例有发作夜间血红蛋白尿,可伴全血细胞减少.其溶血是由于红细胞膜的获得性缺陷,对激活补体异常敏感所致的一种慢性血管内溶血。随着流式细胞仪的逐渐推广，流式细胞术检测CD55、CD59以能从病理上提供直接的证据而得到广泛的应用。正常人的红细胞、网织红细胞、粒细胞、血小板上CD55、CD59表达完全阳性，而PNH患者细胞则分为三型（依据CD55、CD59缺乏或减少的程度）流式细胞术在PNH诊断中须注意的事项：1、尽量同时检测红细胞和粒细胞的CD55与CD59的表达情况。因为PNH克隆来源的红细胞在溶血后和输血后，红细胞中PNH克隆细胞会减少或检测不到，而对粒细胞则影响很小。同时检测红细胞和粒细胞CD55和CD59可以区分小细胞低色素性贫血和PNH，小细胞低色素性贫血只有红细胞上的CD55和CD59减少，粒细胞上CD55和CD59正常。2、在检测红细胞的CD55与CD59时，可以用全血标记，但必须稀释。而在检测粒细胞的CD55与CD59的表达时，必须先溶血再标记。因为红细胞数远远高于粒细胞，红细胞的存在会与粒细胞竞争对CD55与CD59的结合。7、多发性骨髓瘤（MM）多发性骨髓瘤是浆细胞异常增生性疾病。正常浆细胞为CD38+/CD45dim/-，使用CD38/CD45双标记检测外周血和骨髓标本，可以准确划定浆细胞群。通常使用CD38和CD45，结合轻链检查，对多发性骨髓瘤细胞进行分析。另外，正常浆细胞的表面标记为CD19+/CD56-，而多发性骨髓瘤细胞通常为CD19-/CD56+。这样，使用流式细胞仪对外周血或骨髓标本进行多参数分析，并计算异常浆细胞含量，对于多发性骨髓瘤的诊断和治疗评估具有重要意义。8、血液免疫性疾病1.自身免疫性溶血性贫血2.特发性血小板减少性紫癜（ITP）3.免疫性粒细胞减少症以上疾病一般检测红细胞、血小板、粒细胞相关的IgG,IgM,IgD,补体C3等，用以鉴别诊断和辅助临床治疗。9、血液病的其它检查(1)细胞凋亡的检查●Fas及FasL●Apo2·7●bcl-2●TUNEL●AnnexinⅤ●Caspase(半胱氨酸蛋白酶)(2)细胞DNA分析(3)白血病残留病灶检查(MRD)