植物总RNA的提取方法

实验二、植物总RNA的提取一、实验目的：1.了解真核生物基因组RNA提取的一般原理。2.掌握Trizol提取RNA的方法和步骤。3.了解RNA纯度的检测。二、一般原理Trizol试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解蛋白质和其它成分,使蛋白质与核酸分离,失活RNA酶,同时能保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNATrizol试剂配制苯酚饱和液（38%）-380ml/l硫氰酸胍盐（0.8M-118.16g）硫氰酸铵（0.4M）--76.12g醋酸钠pH5（0.1M）-33.4ml甘油–50ml加水至1L三、材料植物组织四、设备移液器，冷冻高速离心机，低温冰箱，台式高速离心机，液氮罐，陶瓷研钵，1.5ml离心管。五、试剂1、无RNA酶的无菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃2小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。3、氯仿:异戊醇[24:1（v/v)]、氯仿。4、异丙醇、无水乙醇、70％乙醇。5、Trizol试剂。六、操作步骤1、取植物嫩叶，液氮研磨，每1.5mltube分装0.1克样品；２.每管加入0.5mlTrizol液，迅速混匀，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。３、室温下静置5～１０分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离４、加入0.5ml的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，室温静置５分钟５、10000r/min离心10分钟６、取上清液（水相）转入一新的离心管，加入等体积异丙醇，室温放置10分钟，10000r/min离心10分钟。７、弃去上清液，加入至少1ml的70%乙醇，涡旋混匀，4℃下７５００r/min离心5分钟。８、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于TE或DEPC处理过的水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃七、检测1、DNA的紫外分光光度计检测OD260/OD2801.81OD260=40μg/mLDNA2、甲醛变性琼脂糖电泳检测八、注意事项（1）Trizol、DEPC等有毒，与皮肤接触会引起伤害。操作过程带手套，在通风条件下操作。（2）避免带入RNase进入样品带手套，别用手碰任何与样品接触的物品。使用新的已灭活RNase的塑料器皿与用具。（3）爱护仪器设备,安全操作作业：1、RNA酶的变性或失活剂有那些？其中在总RNA的抽提中主要可用哪几种？2、怎样从总RNA中进行mRNA的分离和纯化。补充：ＤＮＡ检测方法１.此外分光光度计检测ＯＤ２６０值＝１时，相当于含５０μg/mLDNAＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝１.８～１.９时，DNA较纯小于１.８时，蛋白含量较高，大于２.０则含有ＲＮＡ或有断裂ＤＮＡ植物总RNA的提取规程2007-07-3100:00:00来源：评论：0我要评论一、实验目的掌握植物总RNA提取的原理和方法二、实验原理RNA的提取：破坏细胞膜—除去蛋白—除去DNA—除去盐离子。RNase是一类生物活性极其稳定的酶类，能耐高温、耐酸、耐碱，高压灭菌处理也不能使其完全失活。在提取RNA实验中，要尽量抑制RNase的活性。DEPC（焦磷酸二乙酯）是很强的…一、实验目的掌握植物总RNA提取的原理和方法二、实验原理RNA的提取：破坏细胞膜—除去蛋白—除去DNA—除去盐离子。RNase是一类生物活性极其稳定的酶类，能耐高温、耐酸、耐碱，高压灭菌处理也不能使其完全失活。在提取RNA实验中，要尽量抑制RNase的活性。•DEPC（焦磷酸二乙酯）是很强的RNase抑制剂，可以使RNase的活性丧失。实验中使用的枪头、EP管、溶液都要利用0.1%的DEPC处理，Tris不可以用DEPC处理。耐高温的玻璃器皿等要在250℃烘烤4小时以上。•内源的RNase一般利用蛋白质变性剂除去。如苯酚、氯仿、胍、SDS、十二烷基肌氨酸钠等。无水乙醇、高浓度的盐溶液和异丙醇中可以沉淀RNA或DNA，前两者利于沉淀大片段的核酸。注意：DEPC是一种具有致癌嫌疑的有机物！相关操作要在通风橱中完成。另外DEPC对单链的DNA或RNA具有破坏作用，利用DEPC处理过的溶液和物品都要经过高温灭活处理后才可以使用（DEPC会分解成水和CO2）。所有沾染DEPC的液体或物品在使用、遗弃前要高温灭活处理。RNA操作的整个相关实验过程应该在超净台上完成,操作者应配带口罩、帽子和手套。三、实验材料、器具及药品小麦叶片。高速离心机、研钵、药匙、滤纸、冰盒、口罩、手套、EP管架、超净工作台、移液器、枪头等。预冷的乙醇和70%乙醇、液氮、RNA提取试剂盒等。四、实验步骤1.打开超净工作台和紫外灯，用乙醇烧研钵、药匙。2.样品的裂解:液氮中将组织捣成粉末，液氮挥发后加1mlA液，立即用移液器抽打均匀。-20℃冰上静置10min，加200µlB液，用力颠倒混匀（20余次），冰上静置10min，室温离心12000rpm，10min。3.小心将上层水相移到另一个离心管中，加等体积B液，颠倒混匀（20余次），冰上静置10min，室温离心12000rpm，10min。4.再小心将上层水相移到另一个离心管中，加等体积C液，颠倒混匀，冰上静置30min，室温离心12000rpm，10min。5.弃去上层水相，加400µlE液和40µlD液，混匀后55℃水浴5-10min，中间摇动一次。6.将上清移到另一个离心管中，加1ml预冷的乙醇，颠倒混匀，冰上静置30min，室温离心12000rpm，10min。7.弃去上层水相，加1ml预冷的70%乙醇,转动清洗后倒掉乙醇，在超净工作台上吹干。8.加20µlE液溶解RNA，4℃保存备用。TRIZOL法提取植物总RNA所用器皿均按RNA提取的常规方法处理。具体程序为：（1）：取材料，加液氮研磨，在1.5ml离心管中，分别加1mlTRIZol（Tiangen）[或RNAiso（TAKALA）]试剂，在离心管中加5-6勺样品，约1g，用力摇15秒（也可涡旋），室温静置15分钟；（2）加200ul的氯仿上下颠倒混匀，室温静置2min；（3）4℃，12,000g离心15分钟；（4）将上清液移入新的1.5ml离心管，分层，下层红色酚层，界面，上层水相（含RNA）；（5）加入等体积的异丙醇沉淀RNA（一般500-700ul），轻微颠倒，-20℃沉降1h（此过程可延长）（6）4℃，12,000g离心15分钟；（7）弃上清，加1ml75%乙醇，轻微颠倒，清洗沉淀，在7,000g，4℃，离心5分钟；（8）弃上清，风干（不能太干否则RNA很难溶解），加适当体积RNase-freewater溶解。1.2.2总RNA定量与完整性检测（1）定量：测A260nm、A280nm处的吸光值，计算A260/A280的值，以估计总RNA纯度。通过A260的值计算总RNA量。（2）RNA完整性检测：在1.2%普通琼脂糖胶上分离总RNA，若有三条(代表rRNAs)条带清晰，无拖尾的带（如图），则说明总RNA完整，可用于后续实验。28S：4800nt；MW:1.6×10的6次方18S：1900nt；MW:6.1×10的5次方5S：120nt；MW:3.6×10的4次方