槲寄生抗氧化活性研究(钟文武)

民间药用植物扁枝槲寄生多糖体外抗氧化活性研究钟文武1彭文书1余正云2陈毅坚1*(云南民族大学化学与生物技术学院，云南，昆明650500)（西双版纳职业技术学院，云南，西双版纳，666100）摘要：采用水提醇沉的方法对两种不同寄主扁枝槲寄生中的多糖进行了提取，粗步纯化，测定了其中多糖的含量，并利用分光光度法研究了两种样品中的粗多糖对Fenton反应产生羟自由基、邻苯三酚自氧化产生超氧阴离子自由基以及DPPH﹒的清除作用，同时利用硫代巴比妥酸(TBA)分光光度法研究了两种样品粗多糖对·0H诱发卵磷脂脂质过氧化损伤的抑制作用。实验结果表明，两种样品粗多糖对自由基清除作用，对卵磷脂脂质过氧化损伤也有一定的抑制作用。关键词：扁枝槲寄生，粗多糖，抗氧化活性StudyontheAntioxidativeActivityofPolysaccharidefromViscumarticulatumofFolkMedicinalPlantsZhongWenwuPengWenshuYuZhengyunChenYijian*(SchoolofChemistryandBiotechnology，YunnanNationalitiesUniversity，Kunming650500)(XishuangbannaVocationalandTechnicalInsitute)Abstract：PolysaccharidefromViscumarticulatumofdifferenthostswasextractedandpartiallypurifiedwithhotwaterandethanolprecipitation,andthecontentofcrudePolysaccharidedetermined.ScavengingeffectsofcrudePolysaccharideonactiveradicalssuchashydroxylradicalgeneratedbyFentonreaction,superoxideanionradicalgeneratedbyautoxidationof1,2,3-BenzenetriolandDPPH﹒weretestedbymeansofspectrophotometry;simultaneously,theinhibitionaleffectsofcrudePolysaccharideonthelecithinlipidperoxidationwereobservedthroughThiobarbituricAcidspectrophotometry．TheresultsshowedthatthecrudePolysaccharidefromViscumarticulatumofdifferenthostshassomescavengingeffectsonactiveradicalandinhibitionaleffectsonthelecithinlipidperoxidationtosomeextent.Keywords:ViscumarticulatumCrudePolysaccharideAntioxidation槲寄生为桑寄生科（Lorantheceae）槲寄生属（Viscum）半寄生常绿植物，常寄生于桑科、茶科、山毛茛科、芸香料、蔷薇科、豆科、壳斗科等29科50余种植物上[1]。其作为我国传统的药用植物，具有祛风湿、补肝肾、强筋骨、治疗胃病、腰腿痛、原发性高血压、妇女妊娠胎动不安、咳嗽、冻伤等药理作用[2]。扁枝槲寄生（Viscumarticulatum）是槲寄生属植物[3]，主要分布在云南、贵州、广西、广东、湖南、湖北等省，在云南主要分布在丽江、迪庆、怒江、普洱、版纳、禄劝等地，经调查表明，丽江的纳西族主要用其来治疗风湿病；迪庆和怒江的傈僳族则主要用来治疗胃炎、肝炎、肠炎；普洱江城的哈尼族则将其与其它药物配伍使用。近年来，国内外对槲寄生开展了大量的研究，不仅对其分类鉴定做了大量工作，还对其化基金项目:云南省教育厅科学研究基金项目:2010Y428。*通讯作者:陈毅坚(1966～),女,副教授,研究方向:民族药资源开发和利用。Email:[e-mail]学成分及药理作用进行了分析评价，经研究表明槲寄生多糖具有提高免疫力、保护动物免受放疗化疗损伤的作用[4]、抗炎症、抗癌[5]等作用，但对槲寄生多糖的抗氧化活性研究较少。鉴于此，本文将对两种不同寄主的槲寄生的多糖进行体外清除自由基及抗氧化作用的实验研究，为揭示该药材的活性机理及为所含多糖的开发利用奠定基础。1．仪器与材料1..1仪器UV-1800紫外分光光度计；7200型可见分光光度计；旋转蒸发仪；电子天平；离心机。1.2试剂与材料扁枝槲寄生，寄主分别为花椒树（无患子目Sapindales芸香科Rutaceae花椒属Zanthoxylum）和板栗树（壳斗科Fagaceae栗属Castanea板栗C.mollissima），标本采自云南迪庆维西，经鉴定后保存于云南民族大学化学与生物技术学院实验室，实验材料60℃干燥粉碎，过60目筛，保存备用；DPPH、邻苯三酚、卵磷脂、蒽酮、葡萄糖、硫酸、乙醇等试剂均为分析纯。寄主为花椒树的扁枝槲寄生标记为：样品1；寄主为板栗树的扁枝槲寄生标记为：样品2。2．实验方法2.1样品粗多糖的提取与处理取样品粉末5.00g，按料液比1∶30加入蒸馏水，微波提取10min,离心获得样品粗多糖提取液，石油醚萃取去除叶绿素，提取液用95%的乙醇沉淀过夜，离心获得沉淀后复溶，加入3倍体积的sevag试剂脱蛋白三到五次后，作为供试液备用。2.2提取液粗多糖含量的测定[6]2.2.1最佳测定波长的选择及标准曲线的制作准确称取100mg分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至100mL，使用时稀释10倍（0.1mg/mL)；称取0.1g蒽酮溶于100mL80%硫酸中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶中，冰箱保存。分别取0.6mL葡萄糖标准溶液和样品多糖溶液，加入蒽酮试剂5mL，用蒸馏水补足6mL，沸水浴加热10min，冷却后在500-800nm范围内扫描，得到最大吸收波长。分别取稀释后的葡萄糖标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于试管中，加入5mL蒽酮试剂，补足6mL，摇匀后沸水浴加热10min，取出冷却，在最佳吸收波长下测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标绘制标准曲线。2.2.2提取液中多糖含量测定与计算样品提取液稀释100倍后按2.2.1方法进行显色测定其吸光度，平行测定三次，并按标准曲线方程计算出提取液中多糖的含量，计算相对标准偏差（RSD）。2.3粗多糖抗氧化性能的研究2.3.1清除羟基自由基活性的测定[7]采用Fenton产生的羟自由基可使番红花红褪色的特点来研究样品多糖提取液对羟基自由基的清除能力。取0.05mol/LpH7.4的磷酸缓冲溶液1.0ml,40μg/ml番红花红1.0ml,0.945mmol/LEDTA-Fe(Ⅱ)(新鲜配制)1.0ml,样品粗多糖溶液0.5ml、3%H2O21.0ml(新鲜配制),混合后在37℃水浴中反应30min后在520nm处测定吸光度As。空白组以0.5ml蒸馏水代替样品测定吸光度A0,对照组以1.5ml蒸馏水代替H2O2和样品测定吸光度A,用3.5ml蒸馏水代替番红花红、EDTA-Fe(Ⅱ)、H2O2、样品,1.0ml磷酸盐缓冲溶液调零。并按下式计算清除率：S00A-A%=100%A-A清除率（）2.3.2对羟自由基诱导的脂质过氧化的抑制作用[8]取1ml卵磷脂溶液(取200mg卵磷脂溶解于30ml0.05mol/LpH7.4PBS,冰浴震荡),加入pH7.4PBS缓冲液1.0ml,不同浓度的样品粗多糖溶液1.0ml,2.5mmol/LEDTA-Fe(Ⅱ)1.0ml,混匀后于37℃水浴中反应45min,再加入28%(W/V)的TCA2.0ml,1%(W/V)的TBA1.0ml,混匀后置于100℃沸水浴中加热10min,冷却后在532nm处测定吸光度A样,用PBS缓冲液调零,空白管用PBS缓冲液代替样品测吸光度A0。并按下式计算抑制率：0样0A-A抑制率%=100%A（）2.3.3清除DPPH自由基活性的测定[9]-[10]分别取各浓度的样品多糖溶液2ml于试管中，加入2.0ml2×10-4mol/L的DPPH溶液，混匀静置30min后，用溶剂作参比测定其在517nm处的吸光度Ai，同时测定2.0mlDPPH溶液与溶剂混合后的吸光度A0，以及不同浓度的粗多糖溶液2.0ml与2.0ml溶剂混合后的吸光度Aj(背景吸收)。根据以下公式计算清除率：j0AA100%Ai-清除率（%）=1-2.3.4对邻苯三酚自氧化的抑制作用[11]参照文献[11]略作修改进行，在试管中加入0.4ml样品粗多糖溶液和4.2ml0.05mol/L、pH为8.2的Tris-Hcl缓冲液，加入0.4ml2.5mmol/L邻苯三酚,混匀后立即在324nm（本实验测定的最佳吸收波长）下测定吸光度A样，用0.4ml0.05mol/L、pH为8.2的Tris-Hcl缓冲液代替样品粗多糖溶液作为对照A对照，以扫描时间为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制抑制曲线。100%对照样品对照A-A抑制率%A（）3．结果与分析3.1多糖含量测定最佳波长的选择葡萄糖标准溶液和样品粗多糖溶液用蒽酮硫酸法显色后，在波长500-800范围内扫描，扫描结果表明：葡萄糖标准品和样品粗多糖都在623nm处有最大吸收，本实验采用623nm测定波长。3.2葡萄糖标准曲线的制作按2.2.1的方法进行，标准曲线回归方程为：y=0.0076*x-0.0718R2=0.99906，由此可知在20-100μg/ml的范围内有较好的线性关系。3.3多糖含量的测定按2.2.2的方法对两样品样液进行三次测定，结果表明经提取、沉淀、去蛋白后样品1、样品2提取液粗多糖含量分别为：7.927mg/ml、8.765mg/ml，测定方法RSD分别为：1.394%、0.902%，二者均小于2%，表明方法有较好的精密度。3.4样品粗多糖清除自由基结果3.4.1清除羟基自由基活性的测定结果图.1样品多糖清除羟基自由基作用Fig.1Scavengingeffectonhydroxylradicalsofsample‵sPolysaccharide由图可知，样品1粗多糖浓度≧1.0mg/ml时对由Fenton反应产生的羟基自由基保持有较好的清除率，最大清除率可达到81.18%，而样品2粗多糖对羟基自由基的清除率为75%,相对于样品1有所偏低，但二者都对·OH有一定的清除作用，说明不同寄主的扁枝槲寄生中的多糖作为其中的抗氧化组分，其活性随着寄主的不同而有所差异。3.4.2对羟自由基诱导的脂质过氧化的抑制作用结果图.2样品多糖抑制脂质过氧化作用Fig.2Theinhibitiveeffectonlipidperoxidationofsample‵sPolysaccharide由图可知，当样品粗多糖浓度为2mg/ml时对脂质过氧化的抑制作用最大，抑制率达到46.65%，但随着多糖浓度的增大，抑制率反而出现下降趋势，没有出现较好的剂量-效应关系，这可能是实验用的多糖溶液不是纯品的缘故；对于样品2粗多糖，当其浓度达到6mg/ml时，其对脂质过氧化的抑制率达到49.65%。分析表明不同寄主的扁枝槲寄生多糖对脂质过氧化都有一定抑制作用，且抑制作用差异不大。图.3样品多糖清除DPPH自由基活性Figure.3ScavengingeffectonDPPH·ofsample‵sPolysaccharide结果表明，样品1粗多糖和样品2粗多糖都对DPPH自由基有较好的清除作用，在测定的范围，二者对DPPH自由基的清除作用随浓度的增大而增大，有较好的量-效关系，当二者浓度为2.0mg/ml时，对DPPH自由基的清除率达到最大。3.4.3对邻苯三酚自氧化的抑