木霉菌生态学特性研究

2001杨合同，徐砚珂，王加宁，唐文华。木霉菌类生物防治菌的生态学特性。山东植物病理研究。中国农业出版社，北京，Pp132-138木霉菌类生物防治菌的生态学特性杨合同，徐砚珂，王加宁（山东省科学院生物研究所，济南，250014）唐文华（中国农业大学植物病理系，北京，100094）摘要：在多种植物根际能分离到对棉花枯萎病菌有拮抗作用的木霉菌。本文分离并鉴定的拮抗性木霉菌有绿色木霉菌（Trichodermaviride)，哈茨木霉菌（Trichodermaharzianum)和康宁木霉菌(Trichodermakoningii)。木霉菌的菌落伸展速度在菌株间差别不明显。木霉菌菌株的产孢能力比较强，多数菌株在每克培养基中的分生孢子产量均在21×108个/克干重以上。木霉菌可以耐受土壤的抑菌作用，加入土壤7天后的回收率均在13.1%以上；木霉菌接种棉花种子后可以进入棉花植株内部，有的可以到达茎的中部。木霉菌显示出明显的根际效应，不同菌株在棉花根际的定殖能力有很大差异。前言良好的适应性，多机制性和广谱性是木霉菌在生物防治研究工作中受到广泛关注的重要原因。优秀木霉菌类生物防治菌的分离与筛选与样本的来源有很大关系，普遍认为生防菌株应当尽可能来自病害衰退田，或者寄主植物的周围环境，如根表，根际及其生长所在的土壤（Bakeretal,1974;Cooketal,1983）。木霉菌分布广泛，能够从很多环境如土壤，污水，植物组织等分离得到，但是木霉菌类生防菌株对于植物是否有选择性，则少有研究。本文采集了多种样品进行木霉菌的分离，以棉花为宿主植物，以棉花立枯病菌、枯萎病菌和黄萎病菌为指示菌株，筛选了木霉菌类生物防治菌，研究了他们的生态学特性，希望为木霉菌的宿主专化性提供证据。材料与方法1生防菌株的分离与筛选1.1样品的处理采集并供分离的植物样品12科近20种的植物，分别是禾本科：小麦、早熟禾；豆科：蚕豆；菊科：泥胡菜；十字花科：播娘蒿；锦葵科：木槿，棉花；百合科：葱、蒜；堇菜科：紫花地丁；蔷薇科：玫瑰、西府海棠；栋科：香椿；忍冬科：锦带花；伞形科：芹菜；大戟科：菠菜，等等。其它样品包括各种食用菌的患病子实体，主要包括木耳、灵芝和各种磨菇。分离时，取植物根际土壤（在实验室内将根系土壤稍风干，轻拍根系，使粘附土壤脱落，然后以灭菌水充分漂洗根上残留的土壤，漂洗液即为根际土样。1.2分离方法木霉菌的分离用PDA培养基(含氯霉素100ppm)。将样品稀释102－105倍，取0.1ml于培养基平板，用灭菌的L形玻璃棒涂匀，置于28℃恒温箱中培养，真菌产孢之前纯化，保存于PDA斜面上。TSM培养基（MgSO4·7H2O0.2g，K2HPO40.9g，KCl0.15g，NH4NO31.0g，葡萄糖3.0g，氯霉素0.25g，玫瑰红0.15g，敌克松60%可湿性粉剂0.3g，PCNB0.2g，琼脂20g）也用于木霉菌的分离（唐文华等，1992）。1.3筛选木霉菌生防菌株的指示性状（1）平板上对目标病原菌的拮抗作用，以抑菌圈的有或无来判断。（2）平板上对目标病原菌的重复寄生能力。以上测定所用的指示菌株为：棉花立枯病菌(Rhizoctoniasolani)Rhs-1，本研究室分离保存；棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)AG-158;棉花黄萎病菌(Verticilliumdahliae)V-19，由中国农业科学院植保所棉病研究室提供。21.4木霉菌的鉴定在显微镜下观察菌丝，分生孢子及厚垣孢子的形态，按Bissett（1984，1991a，1991b，1991c），Rifai（1969）和文成敬等（1993）的方法鉴定。2生态学特性测定2.1拮抗作用测定对于细菌和放线菌，采用双层平板法进行。在平板上点种分离物，在NA培养基上于28℃培养拮抗菌至合适时间，再用氯仿将培养好的菌落熏蒸30分钟杀死，然后将混有病原菌繁殖体的PDA培养基倾于平板上，于28℃继续培养，观察拮抗圈的有无及大小。木霉菌则在PDA培养基上培养24小时后直接接种于混有病原菌繁殖体的PDA平板上，于28℃继续培养，2-3天后观察抑菌圈的大小。2.2重复寄生能力测定在PDA平板上对峙培养挑战病原菌和待测拮抗菌，当两菌落接触后，将平板直接置于显微镜下观察拮抗体对病原菌的寄生现象，包括单位病原菌菌丝上拮抗菌的寄生点，菌丝的寄生方式，在两个菌落交叉处于显微镜下计数病原菌菌丝被木霉菌寄生的百分数，表示寄生能力的强弱。2.3木霉菌生长速度测定制备PDA平板，玉米琼脂（玉米粉3g,琼脂1.6g,水100ml）平板和NA平板，取在PDA平板上活化3次的直径为0.6cm的琼脂块接种于三种平板中央，28℃培养，菌落覆盖整个平板时测量菌落的直径，计算菌落每天的扩展速度。2.4木霉菌分生孢子产量比较比较了三种培养基质（麸皮，木屑和麦糠）中部分木霉菌菌株的产孢能力，将分生孢子含量约为105孢子/克的悬浮液接种到干热灭菌的基质中，使接种后的基质含水量达到65%（W/W），置于灭菌的直径为20cm玻璃培养皿中，28℃条件下培养，培养期间每隔6小时左右用灭菌玻璃棒搅拌一次，6天后分生孢子不再增加，取出培养物，风干，显微镜下计数每克培养物的分生孢子数。2.5土壤抑菌作用对木霉菌的影响于中国农业大学科学园采集健康棉田土壤，风干后分成3份，其中一份不作任何处理，一份121℃蒸汽灭菌，一份加入10ppm的多菌灵，然后接种木霉菌的分生孢子悬浮液于3份土壤样品中，不作处理和加入多菌灵的土壤样品各留下不接种样品作为空白对照，以消除土著真菌菌落的干扰。分生孢子的接种量控制在108cfu/克左右，含水量控制在30%（W/W），接种后立即测定一次木霉菌的实际含菌量，将土壤样品保存于密封塑料袋内，置于28℃环境中。7天后，分离计数木霉菌，以第一次计数为基数，计算回收率。2.6木霉菌进入棉花植株内部播种以木霉菌分生孢子悬浮液处理的鲁棉12号种子于健康土壤中，20-30℃培育，21天后棉花长出真叶时分成根部和茎部两部分，检测木霉菌是否进入棉花植株以及进入到哪一个部位，包括（1）根部；（2）地上部近地表1/3；（3）地上部中间1/3；（4）地上部顶端1/3。分离之前用75%的酒精将组织消毒10分钟，然后用灭菌水充分洗涤。在PDA培养基上分离，于28℃培养。2.7木霉菌在棉花根际的定殖能力测定在健康土壤中播种露白的鲁棉12号种子，用含菌量为108cfu/ml的木霉菌分生孢子悬浮液浇在种子上，合每粒种子0.1ml，盖同样的土壤2cm厚，于20-30℃的温室内培育。30天后，小心地取出棉株，用含有链霉素50ppm的PDA培养基分别测定棉花根际和周围土壤中的木霉菌含量，计算两者比例（R/S），作为木霉菌根际定殖能力的指标。以紧贴根表的土壤作为根际部分，以离植株主根3-5cm，离土表2cm,而且没有须根的土壤作为周围(非根际)土壤。计数时以未接种木霉菌的棉花为对照，扣除背景木霉菌和其它真菌。结果1木霉菌类生物防治菌的分离和筛选1.1分离与筛选3在多数植物根际均能分离到对棉花枯萎病菌有拮抗作用的木霉菌菌株，小麦和棉花根际样品中分离到的拮抗性木霉菌菌株最多，各有14株和18株。可以看出拮抗性木霉菌的来源十分广泛，能从多种植物根际分离到。1.2木霉菌种类鉴定：通过鉴定发现三个木霉菌的种，即（1）绿色木霉菌（Trichodermaviride)，编号为LTR-2，T1-1，T2-1，Q1和Q2为绿色木霉菌；（2）哈茨木霉菌（Trichodermaharzianum)，编号为Tc和T22为哈茨木霉菌；（3）康宁木霉菌(Trichodermakoningii)，编号为Tk。2木霉菌生防菌株的生态学特性2.1木霉菌的拮抗能力用热，微波和用氯仿杀死的木霉菌对三种病原菌都不表现抑菌能力。但是不杀死木霉菌，以木霉菌接种混合有病原菌的PDA平板，培养后则多数可以发现在菌落周围有抑菌圈。测定了19个木霉菌菌株在PDA平板上对棉花立枯病菌，枯萎病菌和黄萎病菌的抑菌圈，几乎所有测试菌株对三种病原菌都有抑菌能力，但是不同菌株的抑菌活性有较大差异，对枯萎病菌抗菌活性较强的菌株有：T1-1，T2-1，T4，T5，T6，LTR-2，Q1，Q2和Sxb，其中以T1-1的抑菌圈最大。对立枯病菌拮抗活性较强的菌株有：T2-1，T5，LRR，LTR-2，Q1和Sxb，而对黄萎病菌拮抗活性较强的菌株有T1，T1-1，LR，LTR-2，Q1和Q2，可见LTR-2，T1-1，T5，Q1和Q2的拮抗活性为最强。2.2木霉菌对病原真菌的重复寄生能力对峙试验中观察到木霉菌与棉花枯萎病菌的菌落相交叉后约4天左右木霉完全覆盖病菌菌落，并大量产孢，显出绿色。在显微镜下可以看到木霉菌对病原菌有明显的寄生现象，寄生方式包括缠绕、平行生长、穿透等。观察表明，所有木霉菌对病原菌的老龄菌丝特别是枯萎病菌的老龄菌丝寄生能力都不强，表现为木霉菌菌落覆盖病原菌菌落的扩展速度减慢而后停止，显微镜下菌丝寄生率明显下降。测定了12个木霉菌菌株对棉花立枯病菌，枯萎病菌和黄萎病菌的重复寄生能力。根据对菌丝的寄生率，可知所有木霉菌菌株都能强烈地寄生立枯病菌，多数菌株（除T22外）也能强烈地寄生黄萎病菌，但是对于枯萎病菌来说，菌株间的差别就比较明显，LTR-2，LRR，LR，Q1，Q2，T1-1，T2-1和T22能100%地寄生枯萎病菌菌丝，而其余4个菌株的菌丝寄生率则较低。这说明木霉菌菌株间的重复寄生能力是不同的，对于不同的病原真菌来说，寄生情况也不同。2.3木霉菌生长速度在PDA，玉米琼脂和NA平板上测定了19个木霉菌菌株的菌落伸展速度于菌株间差别不明显，菌落扩展速度都在3.5cm/天左右。这说明大多数木霉菌属于快速生长类型，依据生长速度来筛选生防菌的价值有限，但是木霉菌快速生长的特性对于菌剂的大量生产十分有用，另外，如果菌株的竞争能力较强，这一特性可以使木霉菌在作用部位迅速建立有效群体，有利于生物防治效果的发挥。2.4木霉菌产生分生孢子的能力不同菌株间以及同一菌株在不同的基质上产生分生孢子的能力有明显的差异。就基质而言，多数菌株在麸皮上的产孢量较高，在木屑和麦糠上的产孢量均少于麸皮。对于不同的菌株而言，产孢量最大的是LR，即LTR-2的紫外诱变株产孢量最大，在麸皮培养基上产孢量达到了104×108/克干重，其次是LTR-2。产孢量最少的是康宁木霉菌Tk7a，在麸皮上的产孢量仅为3.4×108/克干重。多数菌株的产孢量都在20-30×108/克干重之间。2.5木霉菌不同菌株对土壤抑菌作用的耐受能力在灭菌条件下，所有菌株于接种7天以后回收率均较高，最低的菌株Tc回收率也为81.7%，而最高的Tk7a回收率则高达95.4%；天然未灭菌的棉田土壤中，所有菌株的回收率都很低，最低的T6回收率仅为7.4%，最高回收率为T2-1，达到了52.7%；在含有多菌灵的土壤中，同灭菌的土壤相比，所有菌株的回收率均比较低，但都高于不含多菌灵的天然土壤。从不同木霉菌在天然土壤中的回收率来看，有7个菌株的回收率在30%以上，分别是：LTR-2，LR，Q1，T2-1，T4，T11和T22，其中以T2-1和T4为最高，分别达到了52.7%和43.4%，表明这几个菌株耐受土壤抑菌作用的能力比较强。2.6木霉菌进入健康棉花植株内部的能力419个木霉菌菌株进入棉花健康植株内部的能力间存在着很大的差异。所有测试菌株经过种子处理后都不能进入到植株上部1/3的部分，只有T1-1可以经过根部达到植株中间1/3的部位；另有T4可以经过根部达到植株下部1/3的部位，菌株T6，Tc，LTR-2和Sxb可以进入到根部，但是不能达到植株的地上部。不同部位的分离结果表明，木霉菌首先从根部进入棉花植株内部，然后再到达地上部。木霉菌可以进入植株内部这一特性，可以使木霉菌受到棉花的保护，可杀伤棉花内部病原菌，有利于达到长期防治病害的目的。2.7木霉菌在健康棉花根际的定殖19个木霉菌菌株在棉花根际的定殖能力测定结果见表1。不同的木霉菌菌株在棉花根际和非根际土壤中的定