果蔬生物防腐研究进展

果蔬生物保鲜研究进展果蔬采后腐烂损失十分巨大。发达国家为l0%～30%，发展中国家则高达40%～50%。长期以来果蔬采后防腐保鲜主要依靠化学杀菌剂，然而，连续使用化学杀菌剂易使病原真菌产生抗药性，易造成环境污染，易危害公众健康。在农作物大田病害生物防治蓬勃发展的带动下，果蔬生物保鲜成为研究热点，迄今为止，人们已从苹果、柑橘、梨、桃、猕猴桃等10余种水果上筛选出几十种拮抗微生物，但真正能实现商品化应用的仅有：丁香假单胞杆菌(P.syringae)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)、季也蒙毕赤酵母菌(Pichiaguilliermondii)等少数几种拮抗微生物。1生物保鲜微生物种类生物保鲜最早报道是Tronsmo＆Dennis(1977)利用木霉菌(Trichodermasp.)控制草莓灰霉病。在已报道的拮抗微生物中，以细菌(bacteria)、酵母菌(yeast)应用最多。拮抗细菌主要有芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、假单胞杆菌(Pseudomonasspp.)、土壤放射杆菌(Agrobacteriumradiobacter)等。芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)、短小芽孢杆菌(B.pumilis)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)等；假单胞杆菌(Pseudomonasspp.)主要有荧光假单胞杆菌(P.fluorescens)、洋葱假单胞杆菌(P.cepecia)和恶臭假单胞菌(P.putide)等。拮抗酵母菌主要有：季也蒙毕赤酵母菌(Pichiaguilliermondii)、隐球酵母菌(Cryptococcussp.)、罗伦隐球酵母(C.laurentii)、假丝酵母菌(Candidafamata)、季氏假丝酵母(Candidaguilliermondii)、红酵母菌(Rhodotorulaglutinis)、毕赤氏酵母菌属(Pichiamenbranefaciens)、柠檬形克勒克氏酵母(Kloeckeraapiculata)等。2作用机理果蔬采后生物保鲜作用机理主要有抗生、竞争、寄生及诱导抗性。2.1抗生作用通过拮抗微生物分泌抗菌素来抑制病原菌。如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)分泌伊枯草菌素；洋葱假单胞杆菌(P.cepacia)产生吡咯烷酮类抗菌素；木霉(Trichodermasp.)产生吡喃酮等[1]。能够产生抗菌素的微生物主要是细菌，且抗菌素多种多样，不仅同一种细菌可以产生多种抗菌素，而且一种抗菌素也可由多种细菌产生。自1945年Johnson等报道枯草芽孢杆菌产生拮抗物质以来，人们已从枯草芽孢杆菌的不同菌株中分离出几十种抗菌物质，这些抗菌物质是一类从简单分子到复杂化合物即从杆菌肽(bacitracin)，大环脂(cycleopetite)，到类似噬菌体颗粒等不同成份组成的物质，也有一部分低分子量抗菌素、蛋白性抗菌物质。细菌素(Bactericin)是另一类抗菌素，主要成分是蛋白质、多肽、核苷酸、生物碱类。产生细菌素的细菌主要有：土壤放射杆菌(A.radiobacter)、丁香假单胞菌(P.syringae)、菊欧氏杆菌(E.chrysanthemi)、密执安棒形杆菌(Clavibactermichiganesis)、甘蓝黑腐黄单胞菌(Xanthomonascampestris)等。木霉菌通过产生木霉素(trichodermin)、胶霉素(gliotoxin)、绿木霉素(viridin)、抗菌肽(peptideantibiotic)等来抑制病害发生。2.2竞争作用指营养物质和生存空间的竞争，在果蔬生物保鲜中，竞争作用尤为重要[2,3]，由于引起果蔬采后病害的病原菌都是非专化性的死体营养菌，其孢子萌发及致病活动需要大量的外源养分，通过与病原真菌竞争果实表面的营养物质及侵染位点，从而降低果蔬表面病原真菌数量。通过拮抗菌和病原菌联合培养试验结果表明：(1)拮抗菌能抑制病原菌的孢子萌发和生长；(2)拮抗菌抑制病原菌的效果与拮抗菌繁殖体的密度显著相关；(3)外加养分，可以使受到抑制的病原菌部分或完全复活。为了抑制病原菌的侵染，拮抗菌必须在病原菌到达以前或到达以后的很短时间内占据侵染部位。已报道的众多酵母菌如季也蒙毕赤酵母、变黄罗伦隐球酵母、假丝酵母、掷孢酵母等都能够在果蔬伤口部位快速繁殖，其繁殖速度明显快于病原菌，从而造成病原菌失去了繁殖和生长的有效空间。2.3寄生作用以吸附生长、缠绕、侵入、消解等形式抑制病原菌。如拮抗酵母菌分泌胞外水解酶如几丁质酶(chitinases)和β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanases)，将真菌细胞壁的主要成分几丁质和β-1,3-葡聚糖分别降解为几丁质单糖、二糖和寡糖，从而破坏病原菌细胞骨架，表现出明显的抗真菌活性[4,5]；木霉菌通过侵入或穿透寄主菌丝细胞，产生几丁质酶、葡聚糖酶(包括β-1,3-，β-1,4-,β-1,6-葡聚糖酶)以及蛋白酶、脂酶等一系列水解酶类，以此消解病原菌的细胞壁。Castoria[5]等在研究红酵母及隐球酵母对苹果采后病害的生防机制时发现：展青霉(P.expansum)及灰葡萄孢(Botrytiscinerea)细胞壁都可以诱导红酵母及隐球酵母产生胞外β-1,3-葡聚糖酶。在采后生物保鲜中，寄生作用被认为作用不太理想，因为作用缓慢，往往落后于病原菌对果蔬的侵害。另外，拮抗菌的存活与增殖需保持一定的病原菌密度，而果蔬采后生物保鲜，需完全排除和钝化病原菌[6]。2.4诱导抗性诱导植物抗性是生物保鲜的一个重要方面。植物在遭到病原物或非病原物诱导时，常常通过木质素、胼胝体和羟脯氨酸糖的沉积、植物抗菌素的积累、蛋白质酶抑制剂和溶菌酶(几丁质酶和脱乙酰几丁质酶等)的合成来增强细胞壁的抗性，这些过程涉及苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)与超氧化物歧化酶(SOD)等酶的活性。拮抗菌诱导植物抗性在G-细菌如假单胞菌和真菌已有很多报道[7]，Lppolito等[8]发现出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)对苹果的β-1,3-葡聚糖酶、几丁酶和过氧化物酶有明显的诱导作用，范青等[9]发现季也蒙假丝酵母(C.guilliermondii)和膜醭毕赤酵母(P.membranefaciens)可刺激桃果实伤口几丁酶和β-1,3-葡聚糖酶的产生。拮抗效果与拮抗菌、病原菌和植物有关，植物与拮抗菌、病原菌之间的作用涉及分子识别、信号传导和基因表达等一系列过程。如果想对诱导抗性有一个清楚的认识，必须在分子水平上深入了解植物产生诱导抗性的生理生化变化和调控基因。拮抗菌对植物诱导主要产生三方面的效果：a抗病性次生代谢物的大量产生Arras[10]发现拮抗菌(C.famata)可以诱导柑橘产生植保素和7-羟基-6-甲氧基香豆素(Scopoletin)等抗性物质。b细胞组织结构发生变化El-Ghaouth等[11]发现拮抗菌(C.saitoana)可诱导苹果伤口细胞变形，产生乳突结构，抑制病原菌的入侵。c诱导植物产生抗病性某些酵母菌在果蔬上大量生长，可以诱导果蔬产生具有抑菌作用的物质；而有些酵母细胞可以诱导果蔬产生几丁酶、葡聚糖酶及其它酶类，从而抑制病原菌的生长[12]。3生物保鲜应用前景拮抗细菌在离体条件下可产生抗生素类、酶类和挥发性等成分，在果蔬生物保鲜中起到关键性的作用[13]，如由Bacillusspp.产生的多肽类物质对多种植物真菌和细菌病害在活体和离体条件下都表现出很强的拮抗活性。范青等[14,15]对枯草芽孢杆菌果蔬生物保鲜开展了深入地研究。随着研究的不断深入，拮抗细菌产生的抗菌素可能诱发病原菌产生抗药性，对人体健康可能产生不利影响等缺陷引起世人警觉。基于这些原因，对拮抗菌的筛选已从产生抗菌素的细菌转向了不产生抗菌素的酵母菌。如Zahavi等[16]发现假丝酵母(C.guilliermondii)对葡萄灰葡萄孢霉及黑曲霉引起的腐败具有明显抑制效果。范青等[17]发现该酵母菌对桃果实软腐病具有明显抑制效果。4发展趋势4.1建立有效的拮抗菌筛选方法从分子水平上揭示果蔬生物保鲜的生防机制，建立快速、有效的离体方法，筛选更为有效的拮抗菌。4.2利用遗传工程手段构建新的拮抗菌株由于多数拮抗菌抑菌谱较窄，构建基因工程菌，扩大抑菌谱具有重要意义。将胞外水解酶(几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶等)或抗真菌蛋白基因等导人拮抗菌中，从而提高拮抗菌的活性及抑菌谱。如Jone等[18]克隆出杀菌酞A的编码基因，并把它转化入啤酒酵母(Saccharomycescerevisill)细胞，啤酒酵母细胞转化体能很好地阻止毛刺盘孢属霉菌(Calletotrichumcaccodes)孢子的萌发，有效地阻止了西红柿的腐烂。4.3添加低剂量化学杀菌剂，并同各种保鲜措施相结合拮抗微生物在实际应用中，会受各种因素影响而降低其对病害的防效，探讨拮抗微生物间、拮抗微生物与低剂量化学农药混用以及与诱导抗性和采后保鲜处理等措施配合的防治效果，对生物保鲜走向商品化具有重要意义。如Calventz等[19]在研究红酵母对苹果采后青霉菌的抑制作用时发现：在制备红酵母的培养基中添加铁离子，制备的含铁细胞红酵母对霉菌的抑制效果强于不含铁细胞的红酵母，田世平、范青等[20,21]研究发现：丝孢酵母菌液与1～2%的CaCl2配合可显著提高丝孢酵母对苹果灰霉病和青霉病的抑制效果；丝孢酵母与扑海因(iprodione)配合对苹果采后灰霉病和青霉病的抑制效果也明显好于单独使用相同剂量的拮抗菌和杀菌剂。McLaughin等[22]研究发现：在季也蒙毕赤酵母细胞培养液中加入钙盐能提高这种酵母菌的防病效果，同时可降低该菌的使用剂量。也有试验表明，2-脱氧-D-葡萄糖能够提高掷孢酵母抑制苹果青霉菌的效果。为了进一步强化生物保鲜效果，结合保鲜措施，如将微生物抗菌剂与愈伤和热处理、紫外线、改变O2和CO2的浓度、适宜低温等结合，更有利于提高果蔬生物保鲜的功效。参考文献：[1]张维一,毕阳果蔬采后病害与控制[M].北京:中国农业出版社,1996[2]Wisniewski,etal,Biologicalcontrolofpostharvestdiseaseoffruitsandvegetables:RecentAdvances[J].HoltScience,剂1992,27;94-98[3]Lima,etal,EffectivenessofAureobasidiumpullulansandCandidaoleophlaagainstpostharveststrawberryrots[J]PostharvestBiologyTechnology,1997,10:169-178[4]陈三风,李季伦.几丁质酶研究历史和发展前景[J].微生物学通报,1993,20(3):156-160.[5]CastoriaR,CurtisFD,LimaG,eta1.β-1,3-glucanaseactivityoftwosaprophyticyeastsandpossiblemodeofactionasbiocontrolagentsagainstpostharvestdiseases[J].PostharvestBiologyandTechnology.1997,12:293-300[6]Janisewicz,etal.Developmentofamicrobialcommunityofbacterialandyeastantagoniststocontrolwound-invadingpostharvestoffruits[J]ApplEnvironMicrobiol,1995,61:3261-3267[7]LoonLC,BakkerHM,PieterseCMJ.Systemicresistanceinducedbyrhizospherebacteria[J].Ann.Rev.Phy