心肌细胞及心肌组织RT-PCRprotocolbyPs

心肌细胞及心肌组织RT-PCR实验方案2代CFbs（心肌成纤维细胞，40ml培养瓶内，瓶底面积约25mm）换无血清培养基一天，镜下见细胞几乎呈融合状态。实验准备：实验前两天开始：浸泡1.DEPC用纯水按0.1%浓度配制，1.1升（1升浸泡，100ml配酒精）2.Tip10µL200µL1ml（多多益善，尤其是10µLtip）3.EPTube（1.5ml）（多多益善，尤其是需要分装试剂时）4.PCRTube（200µL或500µL）（视情况定）5电泳槽高温烘烤（160度5个小时）三个饭盒（分别装大枪头，中小枪头，EP管）三个玻璃瓶（分装异丙醇，氯仿和乙醇）电泳用1.Agarose2.GoldenView3.DNAMarker4.上样缓冲液0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF30%甘油6×缓冲液，4℃保存5.电泳缓冲液Tris54g硼酸27.5g0.5MEDTA20ml？pH8.0蒸溜水1000ml5×TBE（贮存液）再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml贮存液+450ml水——→500ml工作缓冲液其他：PE手套实验前一天需要准备：一，引物的配制：1.将所合成的目的基因和内参上下游引物(1OD)用0.1%DEPC水溶解。2.根据各个引物分子量的不同，计算加0.1%DEPC水的量，使其终浓度均为20pmol/µl。质量数（µg）=OD值*33分子量=碱基数*324.5摩尔数（nm）=质量数/分子量加入水量（µl）=摩尔数（nm）*1000/203.每条2OD的引物一般可获得0.5mL左右的终容积，所以最好分装后于-20℃冰箱中冻存，放置反复冻融。二，预先混合以下试剂：注：《…》中数字为Takara试剂盒中编号。《11》MgCl220µL《8》10×RTBuffer10µL《5》RNaseFreeWater37.5µL《10》dNTP10µL以上组成Mix液77.5µL三，阳性对照RNA易降解，置于-80冰箱中保存。另外，一些蛋白试剂，如酶，需要分装，避免反复冻融。实验当天需要准备：开机预热紫外分光光度计、PCR仪、水浴箱（60℃）。注意适时将试剂从冰箱中取出，溶解。RNA提取1.每孔加入3mlPBS，冲洗2遍，直至洗净培养基。（如果心肌细胞生长在40ml培养瓶中，则以下所加试剂均需乘以2.5）2.加TRIzol每孔1ml。3.轻柔的用移液枪吹打几次。4.吸取样品到一个1.5mlEP管中5.室温放置5分钟。6.加入0.2ml氯仿（chloroform）。7.用手剧烈震荡ep管15秒，充分混匀。8.12000转4℃离心10分钟。（可利用三次离心时间配做电泳胶）。9.仔细转移上层水相到一个新EP管中，注意千万不能贪多，把中间相和有机相吸入。10.加0.5ml异丙醇（isopropylalcohol）11.室温放置10分钟。12.12000转4℃离心10分钟。13.去上清，加1ml乙醇。14.震荡混匀。15.7500转4℃离心5分钟。16.去上清，简单通风5-10分钟干燥RNA。（不能太干，肉眼不能明显看到水分即可）17.加50µL无RNAase水，吹打数次。18.55-60℃水浴10分钟。19.下一步实验或冷冻保存。此时可以取出RT-PCR的试剂盒，准备解冻。RNA的纯度和浓度检测1)预热紫外分光光度计（进口那台）。使用应用程序中的A260/A280，ssDNA/RNA程序。2)用灭活的DEPC水1000µl调零。3)取RNA样品1µl，加入灭活的DEPC水1000µl，混匀。（如果RNA浓度过稀，则可适当减少稀释倍数，改用微量比色杯。）4)直接读取RNA浓度和Ratio，并根据稀释情况得出实际的RNA浓度，重复操作三次取平均值。5)RNA的Ratio均在1.7-2.0之间。RNA浓度在0.5µg/µl-1µg/µl，分装10µl一管，于-70℃冰箱中冻存。RNA完整性的检测1)制备琼脂糖凝胶，称取琼脂糖凝胶0.4g，加入0.5×TBE缓冲液40ml，微波炉加热至熔化。2)最后配成终浓度为1%琼脂糖凝胶液体。3)加入GoldenView2µl，混匀。4)冷却至室温。5)在水平电泳槽上制胶，凝固后浸入0.5×TBE缓冲液中，除去样本梳。6)取1µgRNA与1.5µl甲醛、4.5µl甲酰胺混合，加入1µl上样缓冲液(0.25%溴酚蓝；40%蔗糖)，75mv电泳至溴酚蓝位于琼脂糖凝胶的2/3处。RT-PCR产物电泳分析1.取10µlRT-PCR产物与2µl上样缓冲液混合后上样于1%琼脂糖凝胶，同时以20µlLadder点样，以0.5×TBE为缓冲液电泳。2.70V电泳至溴酚蓝位于琼脂糖凝胶的2/3后，紫外灯下观察，扫描、拍照并进行图像分析。3.图像分析处理系统进行辉度扫描，并以内参校正作相对量分析，数值以两者之积分吸光度的比值表示。PCR产物测序：扩增好的目的基因的PCR产物(50µl)进行测序。RT-PCR：注：《…》中数字为Takara试剂盒中编号。1，取出一个200µLPCR反应管，顺次加入以下成分：《M》Mix液7.75µL《2》RNaseInhibitor0.25µL《1》AMV0.5µL《3》Random9mers0.5µLRNA样品1µL以上为RT反应体系共10µL2，将反应管置入PCR仪中，按以下设置参数进行逆转录反应：（我已经预设黑PCR仪中Ps--RT1-1程序）30℃10min45℃30min99℃5min5℃5min（1cycle）3，上述逆转录过程完成之后，将此管中另加入以下成分：《9》5*PCRbuffer10µL《5》RNaseFreeWater28.75µL《6》TakaraTaq0.25µL上游引物0.5µL下游引物0.5µL4重新放入PCR仪中按一下方案进行：（本实验方案为ECE-1，其他样品则灵活变通）94℃2min94℃30sec45℃/51℃梯度40sec40cycles72℃30sec72℃7min阳性RNA对照RT部分：《M》Mix液7.75µL《2》RNaseInhibitor0.25µL《1》AMV0.5µL《3》Random9mers0.5µL《14》positivecontrolRNA1µL30℃10min45℃30min99℃5min5℃5min（1cycle）PCR部分：《9》5*PCRbuffer10µL《5》RNaseFreeWater28.75µL《6》TakaraTaq0.25µL《12》F-1Primer0.5µL《13》R-1Primer0.5µL94℃2min94℃30sec55℃30sec30cycles72℃1min72℃7min扩增片断462bp