无角道赛特绵羊精液低温冷冻与保存技术的研究

作者简介：乌兰托娅（1983-），女，内蒙古呼和浩特人，硕士生，研究方向：动物遗传育种与繁殖基金项目：国家农业科技成果转化基金(2008A40084)无角道赛特绵羊精液低温冷冻与保存技术的研究乌兰托娅#1，赖彦#1，周欢敏2*（内蒙古农业大学动物科学与医学学院，呼和浩特，010018内蒙古农业大学生命科学学院，呼和浩特，010018）摘要：采用不同成分的冷冻稀释液对无角道赛特种公羊鲜精进行了低温冷冻与保存的实验。结果显示：葡萄糖3.7g+Tris0.02g+柠檬酸钠3.7g+乙二醇5ml+EDTA0.3g+PS20万IU+蒸馏水100ml作为稀释液冷冻并解冻后活力效果最好，解冻后活力为40%,顶体完整率54%；低温冷冻精液在对解冻温度进行了对比试验，42℃解冻活力效果显著（P0.01）；对稀释液比例进行试验对比，鲜精与基础液1：2比例解冻精子活力极显著于1：1（P0.01）。关键词：稀释液；精液冷冻；精液保存；精液活力；无角道赛特绵羊#同等贡献作者*通讯作者世界畜牧业的发展的主要特征是规模化和现代化，发展的趋势是绿色、安全畜产品的生产。而我国肉羊业产业化水平低，农户养羊多分散饲养，经济效益差。种羊市场发育异常，种羊价格居高不下，严重影响了肉羊繁殖生产体系的形成，阻碍肉羊的产业化生产。本实验主要对无角道赛特绵羊种羊的鲜精进行冷冻保存实验，推广羊冷配技术的突出优点可以大幅度提高优秀种公羊利用率，加速品种的育成，便于羊改良配种工作的操作；大量减少使用种公羊，并可以节省种公羊饲养管理费用。同时，对优良种蓄在短期进行后裔测定，保留和恢复某一品种或个体的优良遗传特性，以及进行血统更新、引种、保种、降低生产成本等发挥重要意义。因此，开展羊冷配可以显著提高羊的品种改良并可使其商品化得到前所未有的经济效益。绵羊精液冷冻技术在20世纪50年代开始，Emmens[1](1950)将绵羊精液在-79℃保存，获得了成功并输精产羔。我国于1974年开始进行绵羊精液冷冻研究。精液冷冻是利用液氮（-196℃），干冰（-79℃）等作冷冻源，将精液经过特殊处理后，保存在超低温下，达到长期保存的目的。无角道赛特绵羊是世界著名优良肉毛兼用品种，有多种优良种质特性，如，生长发育快，肉用性好，较强的适应性和抗病性，早熟多胎，常年发情等，是目前世界上生产羔羊最好的终端父系品种之一。目前，应用羊精液冷冻较先进的国家有：法国，英国和俄罗斯，受胎率可达60%以上，最高的是法国，可达75%。在我国开展羊冷冻精液制作与应用的地区主要是新疆，内蒙古，辽宁和山东，受胎率在50%—60%的水平。因此，绵羊精液冷冻稀释液的配制是非常重要的，它直接影响着精液解冻后的活力，细胞顶体完整率，受胎率等等。1材料与方法1.种羊的选择与精液采集1.1种羊的选择试验选择膘情中等，体质健康，性欲旺盛的同品种公羊。本实验采用为内蒙古赛澳牧场科技发展有限公司种公羊无角道赛特种公羊5只。1.2精液采集采用人工假阴道采精，精液采出后，立即在35℃~38℃下镜检。所采集的精液必须没有异常的气味，色泽为乳白色，精子形态正常，畸形率5%以下。采集精液活力在0.8以上方可用于冻精。器械为精液采集及冻精制作常用器械及设备。21.3药品葡萄糖，蔗糖，乳糖，柠檬酸钠，Tris，乙二醇，甘油，PS双抗，EDTA，卵黄等。以上试剂均为国产。2.精液稀释和平衡2.1第一次稀释和平衡鲜精与基础液按1:1—1:2比例等温稀释，然后用8—10层纱布包裹储精瓶，降温后，置于4℃冰箱中平衡1h。2.2第二次稀释和平衡将经过第一次稀释和平衡的精液在冰箱内按1：1的比例加入含冷冻保护剂*的等温稀释Ⅱ液后，用精液分装机分装到0.5ml细管内并封口，再放入4℃的冰箱中继续平衡2-4小时。2.3细管精液冷冻将液氮倒入冷冻箱，待液面平稳后，再将细管架放入冷冻箱内使细管距液面2cm左右，冷冻5分钟之后，做好标记最后放入液氮罐内保存。3.解冻从液氮中取出细管，空气中稍停留10s，投入40℃—45℃水中解冻15—20s，进行活力鉴定和计数及顶体完整率计算.4.计算4.1精子活力鉴定呈直线前进运动的精子数精子活率=————————---------100%总精子数在显微镜下观测，呈直线运动的的精子，当活率为100%称为1.0级，活率90%为0.9级，下面以此类推。4.2精子顶体异常率的计算用吉姆萨染色法染色后，将精液染片置于显微镜下，在1000倍油镜下观察。染色后的精子顶体呈紫色，包围精子头部。根据顶体完整情况分为4种：完整型、膨胀型、破损型、全脱型。顶体各异常精子数精子顶体各异常率=-------------------100%精子总数精子顶体完整率=（1-精子顶体总异常率）100%2.结果与分析2.1不同稀释液对精子冷冻保护的影响在本试验研究中，共采用了5种不同配方的稀释液（表一），对不同稀释液对精子冷冻保存后解冻活力集中对比实验。对比解冻后活力发现，从表二可以看出，E与D两组比较，用乙二醇作为冷冻保护剂对精子解冻后的活力比较高，达到了0.43±0.028，活力极显著高于对照组（P0.01）;C、D两组，其中C组添加了EDTA，精子冷冻后效果相比D组较好，极显著高于A、B对照组（P0.01）；BC两组添加了乳糖，明显比A组未添加的解冻后活力高。3表一4种基础稀释液配方稀释液配方Solutioncomposition葡萄糖/g蔗糖/g乳糖/gTris/gEDTA/g柠檬酸钠/g乙二醇/ml甘油/mlPS/万IUGlucoseSucroseLactoseSudiumcitrateA1.72.0-2.42-1.38-520B3.7-5.5--1.5-520C3.7-4.6-0.31.5-520D3.7----3.7-520E3.7--0.020.33.75-20表二5种不同配方稀释液精子解冻后活力稀释液SolutionABCDE解冻活力Viability0.35±0.0230.38±0.0200.42±0.0280.38±0.0240.43±0.028表三不同配方稀释液精子解冻后的顶体完整率稀释液SolutionABCDE顶体完整率thefullrateofacrosome0.42±0.030.42±0.030.49±0.020.50±0.030.54±0.03由表二和表三共同可对比出，E稀释液内添加Tris和EDTA，并且在二次稀释后冷冻试剂添加为乙二醇，解冻后活力效果最好，精子活率极显著于其它对照组（P0.01）活力为0.43±0.028,并且可以极显著减缓精子顶替总异常率的发生（P0.01）顶体完整率为0.54±0.03。2.2不同解冻温度对精子活力的影响表四不同解冻温度后的精子活力温度(℃)Temperature404142434445活力Viability0.36±0.010.39±0.020.40±0.020.38±0.20.39±0.010.38±0.01由表四可得出，不同解冻温度对精子活力有极显著影响，在42℃解冻的精子解冻后活力效果最好，达到0.40±0.02。3.讨论43.1稀释液成分对精液冷冻保存的影响通过实验筛选出E液为最佳冷冻稀释液。可能是E液中添加了EDTA和Tris对精子有良好的保护性。绵羊精液有其特殊性，有较高的代谢水平，在氧的作用下可以迅速氧化导致精子中毒和死亡【2】。另外，导致绵羊冷冻精液受胎率低的原因之一是溶血卵磷脂积累所造成的副作用，EDTA是抑制卵磷脂酶活性的物质【3】。因此，稀释液中加入EDTA有利于精子的保存。Tris还具有良好的缓冲性和渗透性，并且高浓度时对精子的毒性也降低（Nahas,1961）,是经过筛选获得的【4】.3.2冷冻保护剂对精液冷冻的影响近年来在动物胚胎冷冻保存方面的研究发现，乙二醇的冷冻效果不亚于甘油，其分子小、毒性小、渗入或渗出细胞的速率与水分子差异不大，所以渗透压反应也较小。而且乙二醇在在常温下(15℃~20℃)对精子无毒害作用，用乙二醇作为精液冷冻保护剂具有比甘油好的效果【5】。其原因可能在温度较高时加入，既无毒性又可充分渗透到精细胞内，使精子在快速冷冻过程中更易达到非晶状态，不易形成冰晶，从而降低细胞内冰晶的数量和体积，对精子起到保护作用【6】。从本实验D与E两组的研究实验对比中，E组用乙二醇解冻后效果明显高于D组用甘油作为冷冻保护剂的活力（表二）。3.3不同营养剂对精液冷冻的影响据Nauk【7】报道，几种糖类稳定细胞膜蛋白质-脂质复合物的性能大小顺序为棉子糖蔗糖乳糖果糖葡萄糖，而且两种糖配合使用的效果比单一使用较好【8】。糖对稀释液渗透压和精子膜都有一定影响，防止冰晶的形成等保护冷冻对精子造成的伤害。因此，BC两组的精子活力明显高于A组，A组蔗糖与葡萄糖共同协作作用大概不如与乳糖的效果好。3.4解冻温度对精子活力的影响精液的解冻过程很重要，解冻的速率和温度会影响精子活力的恢复。在-196℃的冻精解冻过程需经过精子的-15℃~-60℃危险温区。经过长期的实验40℃~45℃解冻的温度效果优于其他解冻温度。对比中，我们主要采用的是42℃来解冻。活力相比要其他高。3.5稀释液比例对精子冷冻的影响绵羊冷冻稀释液的倍数，一般都在5倍以下。这可能于绵羊子宫颈通道狭窄、弯曲多皱，不能做到深部输精，和绵羊精子顶体经过冷冻、解冻后损坏程度严重有关。所以绵羊精液在冷冻前稀释比例多为1：1或1：2.我们经过多次试验，1：2效果较明显【9】。参考文献〔1〕郭年藩摘译。绵羊精液保存技术研究综述（上）〔J〕.国外畜牧科技。1995，22（3）:30~34〔2〕李青旺，武浩。动物繁殖学〔M〕。西安地图出版社出版。2000，3〔3〕Ollerom,Cebrian-perezJA,Muino-Blanco.Improvementoframspermcryoprecerationprocotolsassessedbyspermqualityparametersandheterogencityanalysis〔J〕.Cryobiology,1998,37:1~12〔4〕杨凌，张乐颖，等。白萨福克羊细管冷冻精液实验〔J〕。安徽农业科学。2006，34（3）：481~482〔5〕刘玉峰。乙二醇对绵羊东京效果的研究〔J〕。中国草食动物，2002，22（6）：9~11〔6〕哈敏，张德喜，史远刚。绵羊精液冷冻保存技术的研究进展〔J〕。宁夏四正生物工程技术研究中心。2006，2,1~2〔7〕NaukVA.Changeinmembranepermeabilityandresistanceofprotein-cholesterolcomplexundertheinfluenceoftechnologicalprocessingofsemen(inRussian)〔J〕.Cryobiology.1998,37:1~12〔8〕NaukVA.StructureandFunctionofSpermofFarmAnimalsDuringCryopreservation(inRussian)〔J〕.StiincaKishinewMoldavia,1991,17:1995〔9〕哈敏，张德喜，史远刚。绵羊精液冷冻保存技术的研究进展〔J〕。宁夏四正生物工程技术研究中心。2006，2,1~2