斜带石斑鱼肠道乳酸菌部分生物学特性研究

斜带石斑鱼肠道乳酸菌部分生物学特性研究摘要:体外检测了3株斜带石斑鱼(Epinepheluscoioids)肠道乳酸菌的产乳酸能力、抑菌活性、对高温、低pH值、高胆盐、人工胃液及人工肠液的耐受能力等，为海水鱼益生菌的开发提供理论依据．16SrＲNA基因测序分析表明，LS61、LS64、LS77菌株分别为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、糊精乳杆菌(Lactobacillusdextrinicus)．3株菌摇瓶培养40h后发酵液中乳酸含量分别达到55.6、51.6、58.3mmol/dm3且发酵上清液对致病菌有较强的拮抗活性．耐受性实验结果表明，pH值为3.5、4.5的MＲS培养基对这3株菌存活影响较小;pH值为2.5的MＲS培养基对LS64、LS77的影响较大，而对LS61菌株的存活基本没有影响．这3株菌对不同pH值的人工胃液的耐受性与之相似，说明LS61菌株的pH值耐受性最好，其次是LS64菌株，LS77菌株最差．3株菌对高胆盐也有不同的耐受性，含1‰和2‰胆盐的MＲS培养基对3株菌的影响较小，而在3‰的胆盐处理4.5h后，LS64菌株的存活率仍保持在30.7%，LS61菌株的存活率为2．0%左右，LS77菌株的存活率接近1．0%．在4‰的胆盐含量下，LS61、LS64菌株的存活率仍高于1‰．同样，不同胆盐含量的人工肠液对这3株菌的影响与之相似．乳酸菌LS61、LS64菌株具有较强的产乳酸和抑菌能力，具有一定的pH值耐受性和较高的胆盐耐受性，可考虑作为潜在的益生菌株应用于水产健康养殖．关键词:海洋生物学;斜带石斑鱼;乳酸菌;抑菌活性;pH值;胆盐;益生菌随着石斑鱼养殖的兴起和高速发展，在带来巨大经济效益的同时也出现了一些问题．石斑鱼细菌性疾病和寄生虫病害严重，抗生素等药物的频繁使用导致致病菌耐药性的增强，解决这些问题就需要探寻一种绿色的养殖模式，需要一种高效生态的方法来控制细菌性病害．因此，许多科学家都期望利用微生物之间的拮抗作用预防和治疗石斑鱼细菌性疾病［1-3］．乳酸菌作为益生菌已被广泛应用于人体的保健医疗、健康和食品等多个方向．如Youn等(2012)用流感病毒感染BALB/c小白鼠，发现活的乳酸菌对增强免疫有显著效果，提高了小白鼠的存活率［4］．Matsumoto等(2006)研究证实含乳酸菌的牛奶对稳定人体肠道环境和微生物菌群具有积极作用［5］．Burns等(2012)从奶酪中分离得到2株乳酸菌，将其用于发酵奶酪，与不加乳酸菌的对照组进行氨基酸含量、食品风味等进行比较，发现添加乳酸菌发酵的奶酪中氨基酸含量和风味明显好于对照组［6］．乳酸菌在畜禽养殖上的应用也取得了较大进展，如Zhang等(2012)发现罗伊乳酸杆菌(Lactobacillusreuteri)能提高患白痢雏鸡的存活率［7］．此外，乳酸菌在水产养殖上的应用也取得了一定成果，如刘倩等(2006)阐述了乳酸菌对提高鱼类抗病力、生长速度和存活率的重要作用［8］;Lara-Flores等(2003)发现将粪链球菌(Streptococ-cusfaecium)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophi-lus)添加到饲料中投喂可以促进尼罗罗非鱼(Ore-ochromisniloticus)鱼苗的生长，提高饲料利用率等［9］;Suzer等(2008)研究发现，乳杆菌投喂处理等显著提高金头雕(Sparusaurata)幼体的存活率、4期陈艳武，等:斜带石斑鱼肠道乳酸菌部分生物学特性研究·531·特定生长率和肠道酶活［10］．尽管乳酸菌在水产养殖上应用的报道不少，但是，由于缺乏真正适合水产动物的益生菌株，目前许多水产上使用的益生菌分离自环境或者陆生动物，这些益生菌往往因为无法在水产动物消化道存活而不能发挥益生效果，因而限制了它们在水产养殖上的应用．理想的益生菌应该来自动物自身胃肠道［11-13］．此外，所选用的益生菌还必须能够耐胃肠内强酸、高胆盐的环境，才能够在消化道内大量存活、定植，发挥益生作用［14-15］．本文通过分离斜带石斑鱼(Epinepheluscoioids)肠道的乳酸菌，对其部分生物学特性，包括产乳酸的能力、抑制病原指示菌的能力，以及耐受低pH值和高浓度胆盐的能力等进行了研究，初步评价乳酸菌作为益生菌应用于石斑鱼养殖的可能性．1材料与方法1.1菌株的分离与鉴定1．1.1乳酸菌的分离纯化实验所用的斜带石斑鱼购自厦门市大学路菜市场．取健康活泼的斜带石斑鱼4尾，用75%(V/V)酒精棉球擦拭鱼体表面，在紫外灭菌后的超净工作台中解剖胃肠道，取消化道内容物和消化道粘膜用无菌生理盐水制备成匀浆液，将匀浆液10倍梯度稀释至10－4．取原液和各个梯度稀释液各100mm3分别涂布MＲS平板，每个梯度设3个重复，平板置于28℃恒温培养5d．挑取各种类型单菌落接种至MＲS平板上，多次划线传代，直至镜检确认纯种．对单菌进行接触酶实验，选取接触酶阴性的菌株进行16SrＲNA测序鉴定．1．1.2乳酸菌的鉴定利用细菌基因组DNA提取试剂盒(上海赛百盛基因技术有限公司)提取细菌基因组DNA．以细菌通用引物27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492r(5'-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3')扩增细菌16SrＲNA基因片段．PCＲ反应条件:94℃4min;94℃40s，55℃40s，72℃1.5min，35个循环;72℃10min．用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测16SrＲNA基因扩增产物，扩增产物送上海英骏(Invitrogen)生物技术有限公司进行纯化和测序，序列于GenBank网站上进行BLAST比对分析．1．1.3病原指示菌抑菌试验所用的指示菌哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)QBY3为本实验室分离自患病斜带石斑鱼眼球部位，坎贝氏弧菌(Vibriocamp-bellii)VH1为本实验室分离自患发光病南美白对虾(Litopenaeusvannamei)体内［16］，嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)SHI为山东大学杜宗军老师惠赠，实验证实3株菌对南美白对虾和斜带石斑鱼均具有中等强度的致病性．指示菌均用216L培养基培养．1.2乳酸菌产酸能力的测定将用液体MＲS培养基活化好的乳酸菌以5%(V/V)的接种量接入新鲜的MＲS培养基中，摇瓶培养，每隔4h取样测pH值和乳酸含量．乳酸含量采用南京建成生物工程研究所的乳酸测定试剂盒进行测定．1.3发酵上清液抑菌实验采用琼脂板打孔法进行抑菌实验．发酵上清液的制备:将用液体培养基活化好的乳酸菌以5%的接种量接入新鲜的MＲS培养基中，摇瓶培养48h，4℃条件下6300r/min离心20min，取上清用0.22μm滤器过滤后进行抑菌试验．分别用乳酸调MＲS液体培养基至与3株菌培养发酵上清液相同的pH值，作为对照进行抑菌试验．分别测定乳酸菌48h发酵上清液和对照液的抑菌圈直径．1.4温度对菌株存活的影响在MＲS培养基中接入已活化好的菌种，初始浓度保持在106数量级，然后于28、40、60、80℃处理0、0.5、1.5、3.0、4.5h，取样涂板计数，每个处理3个重复．1.5pH值对菌株存活的影响试验设置了4个pH梯度处理:1.5、2.5、3.5、4.5．分别用1mol/dm3的HCl调节MＲS液体培养基至上述pH值．把用液体MＲS培养基活化好的LS61、LS64、LS77菌株以5%的接种量分别接种至上述各pH梯度处理，28℃静置培养．在接种初始及接种后0.5、1.5、3.0、4.5h取样涂板计数，每个处理3个重复．1.6胆盐含量对菌株存活的影响试验设置了1‰、2‰、3‰、4‰(m/m)共4个胆盐含量梯度处理组，分别用胆盐调节MＲS液体培养基至上述浓度．把用液体MＲS培养基活化好的LS61、LS64、LS77菌株以5%的接种量分别接种上述各处理，28℃静置培养．在接种初始及接种后0.5、1.5、3.0、4.5h取样涂板计数，每个处理3个重复．1.7菌株在人工胃液和人工肠液中的存活人工胃液和人工肠液的配制参照文献［17］的方法，人工胃液中含有1%(m/m)的胃蛋白酶，人工·532·应用海洋学学报32卷肠液中含有1%(m/m)的胰蛋白酶．把用液体MＲS培养基活化好的菌种以5%的接种量分别接种于上述pH值为2.5、3.5、4.5的人工胃液中，28℃静置培养，接种初始及接种后1.5h取样稀释涂板计数．把用液体MＲS培养基活化好的菌种以5%的接种量分别接种于上述胆盐浓度值为1‰、2‰、3‰、4‰的人工肠液中，28℃静置培养，接种初始及接种后3.0h取样稀释涂板计数，计算存活率．1.8数据处理文中pH值、乳酸含量、抑菌圈直径和活菌数量均为3个重复的平均值，数据用统计软件SPSS19.0单因子多重比较中的Duncan进行统计学方差分析，以平均值±标准差表示．2结果与分析2.13株乳酸菌的16SrＲNA鉴定结果如表1所示，根据菌株的16SrＲNA基因测序分析结果，LS61鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillusplan-tarum)，LS64鉴定为肠膜明串珠菌(Leuconostocmes-enteroides)，LS77鉴定为糊精乳杆菌(Lactobacillusdextrinicus)．2.2乳酸菌发酵液的抑菌活性在培养48h的条件下，这3株乳酸菌发酵液对病原指示菌的抑制结果如表2所示．由表2可知，这3株乳酸菌发酵液对哈维氏弧菌、坎贝氏弧菌和嗜水气单胞菌均有较强的抑制效果，抑菌圈直径都在15mm以上．而对照组(用乳酸调MＲS培养基pH值至与培养发酵液相同)对这3指示菌也有一定的抑制作用，但明显弱于乳酸菌发酵液对其的抑制作用，差异显著(p＜0.05)．推测这3株乳酸菌的抑菌作用一方面是由于低pH的作用，另一方面是由于乳酸菌本身产生除乳酸以外的其他抑菌物质．表13株乳酸菌菌种鉴定结果Tab．1Identificationoflacticacidbacteria菌株最近源模式种相似度/%NCBI登录号LS61LactobacillusplantarumATCC14917(T)100.0KC700038LS64LeuconostocmesenteroidesATCC8293(T)99.9KC700039LS77LactobacillusdextrinicusJCM5887(T)99.9KC700040表2乳酸菌发酵液对3种病原指示菌的抑制效果比较Tab．2Inhibitioneffectsoflacticacidbacteriaagainst3pathogenicindicatorbacteria乳酸菌抑菌圈直径/mm哈维氏弧菌QBY3坎贝氏弧菌VH1嗜水气单胞菌SHILS61菌株(pH=4.2)18.5±0.2a18.1±0.2a20.2±0.4a对照(pH=4.2)11.6±0.2b12.0±0.3b12.5±0.2bLS64菌株(pH=4.4)19.0±0.3a18.3±0.5a20.0±0.3a对照(pH=4.4)11.5±0.2b12.0±0.4b12.3±0.4bLS77菌株(pH=4.8)18.2±0.3a18.9±0.6a22.2±0.5a对照(pH=4.8)11.3±0.2b11.8±0.2b12.0±0.3b注:用乳酸调MＲS培养基pH值至与菌株发酵液相同作为对照组．上标注明了数据的统计学方差分析结果，同列上标字母相同者表示不存在显著性差异，同列上标字母不同者表示差异显著(p＜0.05)2.3乳酸菌的产酸能力对乳酸菌发酵液进行连续监测，每4h测一次菌体浓度、pH值和乳酸含量，连续监测48h．其结果表明:这3株乳酸菌都在培养20h左右达到稳定期(图1a)，培养液的pH值随着培养时间的延长呈下降趋势，LS64在20h时左右达到最低点，LS61、LS77分别在24h和32h左右达到最低点，其中LS61、LS64菌株发酵液的pH值最终稳定在4.5左右(图1c)．由图1b