徐敏-低氧诱导因子1在缺氧性疾病中的作用研究

低氧诱导因子1在缺氧性疾病中的作用研究※徐敏，聂时南*江苏南京南京军区南京总医院急救医学科南京大学医学院附属金陵医院210002通讯作者：聂时南，E-mail:[e-mail]，南京市中山东路305号南京军区南京总医院急救医学科，电话：[phone]组织细胞处于氧浓度正常的微环境中是其产生能量以发挥生理功能所必需的。然而，在疾病（如急慢性心血管疾病、肺部疾病及肿瘤等）中细胞微环境往往是缺氧状态。人们对于哺乳动物氧调节的认识源于缺氧诱导促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）的研究，从而发现调节细胞低氧反应的核心因子HIF-1。低氧诱导因子-1（hypoxiainduciblefactor-1，HIF-1）作为调节细胞氧稳态的核转录因子，诱导一系列基因的表达，介导血管生成、红细胞生长、血管内皮生长因子、促红细胞生成素及大部分糖酵解的酶和葡萄糖转运蛋白，为组织细胞提供充足的氧和营养以适应低氧反应。本文仅针对HIF-1在缺血性疾病、炎症和肿瘤中的研究进展做一简要综述。1、HIF-1的结构概述HIF-1为异源二聚体的核转录因子，几乎在所有细胞生物中表达〔1〕，由存在于细胞质中氧浓度敏感的α亚基和存在于细胞核中构建性表达的β亚基组成。α亚基主要结构特征是氨基端存在一碱性螺旋环螺旋（bHLH）构型，其后有一保守的PAS结构域〔2〕，两者均有结合DNA和促使亚基二聚化的功能；羧基末端有氧依赖的降解区域(ODDD)和反式转录激活结构域(TAD)，前者可被脯氨酸羟化酶2(PHD-2)羟基化，后者可调节HIF-1的转录活性。α亚基羧基端转录激活域（CTAD)，可与CREB结合蛋白(CBP)和p300两转录共激活因子相互作用，是发挥HIF-1转录活性所必需的。β亚基是芳烃受体转运蛋白（ARNT）的基因产物，非氧依赖的蛋白，在细胞核中结构性表达。2、HIF-1的调节2.1低氧应答的机制细胞微环境氧浓度正常时，氧分压敏感的PHD识别HIF-1α中ODDD区Pro402或Pro564并将其羟基化，为希佩尔-林道肿瘤抑制蛋白(pVHL)识别，之后形成功能性E3泛素-蛋白连接酶复合物，进行泛素依赖的蛋白酶解。另一控制HIF-1α活性的为氧浓度敏感的天冬酰胺酰基羟化酶FIH(factorinhibitingHIF)，羟基化HIF-1α蛋白，阻断其介导的调节因子转录及共激活因子p300与CBP的招募〔3〕，从而抑制HIF转录活性。然而在低氧浓度时，PHD/FIH介导的羟基化受阻，HIF-1蛋白稳定、活化，累积后进入细胞核与HIF-1β结合形成HIF-1复合物，并招募共激活子p300/CBP结合到保守的[A/G]CGTG缺氧反应元件（HRE)，诱导靶基因的表达。PHD2和PHD3基因亦存在HRE,可形成负反馈环。2.2非氧浓度依赖的调节组织细胞处于正常氧浓度时，亦存在许多激活HIF-1的刺激因素，往往为蛋白质类物质，与缺氧刺激形成鲜明对比，作用于α亚基的转录翻译水平，如蛋白激酶C（PKC）增加HIF-1α转录的效率。PKC信号通路能激活S6核糖体蛋白，磷酸化的S6蛋白可识别HIF-1αmRNA，大大提升HIF-1αmRNA翻译效率，使其产生速率远大于蛋白酶解速率，从而增加HIF-1复合物在细胞核的水平。亦有研究表明，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-Akt-mTOR信号通路可磷酸化4E-BP1，调节HIF-1α翻译过程，增加其蛋白合成〔4〕。多种细胞因子可激活PI3K信号通路如胰岛素样生长因子1(IGF-1)、表皮生长因子（EGF）及脂多糖等，影响血管平滑肌细胞及核巨噬细胞中HIF-1α的激活〔5,6〕。2.3HIF-1的自身修饰HIF-1α亚基自身直接的磷酸化作用增加HIF-1活性，其机制可能是通过阻断蛋白酶体/VHL的识别。HIF-1α自身磷酸化鲜少知道，仅体外实验发现p42/p44有丝分裂原激活的蛋白激酶可磷酸化该蛋白〔7〕。3、HIF-1的主要生物学效应HIF-1与含有低氧反应元件和顺式作用转录调节序列的靶基因结合，从而激活靶基因的转录，诱导多种细胞因子及酶的表达，以应对低氧环境。HIF-1可上调VEGF、FLT-1、ANGII等基因表达影响血管生成，VEGF是最有效及表皮特异性的血管生成调节因子，促进内皮细胞向缺氧区域迁移，形成新的血管，供应缺氧区域含氧量充足的血液；诱导EPO刺激红细胞再生以提高机体血液携氧能力；iNOS、血红素氧合酶(HO1)用于合成NO和CO，影响血管紧张度。HIF-1还可诱导Clutl、Glut3、LDH-A、醛缩酶、烯醇化酶、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)等多种酶缺氧时促进糖酵解从而增加ATP产量〔1,8〕。Kricketal.〔9〕报道肺泡内皮细胞HIF-1过度表达导致凋亡增加；其还可影响凋亡前基因NiP3及抑癌因子P53。4、HIF-1与缺氧性疾病4.1HIF-1在缺血性疾病中的研究在心肌缺血的治疗案例中，HIF-1α的上调可刺激血管生成和血流增加，涉及血管生成的基因如VEGF,基质金属蛋白酶2(MMP2),组织蛋白酶D(CATHD)和角蛋白(KRT)，均为HIF-1转录复合物的靶点。近期研究中，用缺乏ODDD结构域的HIF-1αDNA注射给老鼠，明显增加伤口或者缺血区域的血液供应，表明HIF-1α表达水平的增加有助于供给病灶缺血部分血液和营养物质〔10〕。在鼠心肌梗塞模型中，给予HIF-1α混合物可诱导鼠心肌细胞结构稳定，减少缺血损伤；该混合物包含的DNA结合域来源于HIF-1α的二聚化域和HSVVP16蛋白的转录激活域〔11〕；用siRNA抑制PHD2亦可减少鼠心肌梗塞的面积，另外在保护心肌抵抗缺血再灌注损伤方面，PHD的小分子抑制剂很可能成为临床有效的治疗靶点〔12-14〕。因而，HIF-1的在缺血性疾病中的研究有重要临床价值，为不能实施手术的缺血病人带来希望。4.2HIF-1有助于炎症反应和氧含量的恢复Cramer等〔15〕证明HIF-1是髓系细胞新陈代谢所必需的。HIF-1蛋白在体内过表达诱导局部炎症增加；选择性基因敲除髓系细胞HIF-1α基因，可减弱细胞聚集、迁移和杀菌应答的能力。骨髓细胞对于HIF-1的依赖与糖酵解相关，缺乏该基因细胞不能有效的产生ATP,无法快速迁移到损伤组织或破坏外来入侵者〔15〕。除此，HIF-1α的表达在骨髓细胞分化成单核细胞和巨噬细胞有着重要的作用〔16〕。可见，HIF-1在炎症反应中有着重要的作用〔13,17〕，为将来拓宽抗炎药物研究领域提供理论依据。4.3HIF-1在肿瘤中的研究进展众多研究发现HIF-1α在食管癌、肺癌、卵巢癌等多种肿瘤细胞中过表达，并且在多种转移瘤中亦有HIF-1α表达量显著增加，可见肿瘤的发生发展与HIF-1α的表达密切相关。如前所述，HIF-1调控多种靶基因的转录，从而发挥其生物学效应。肿瘤组织中，随着肿瘤细胞不断生长，其体积变大，导致肿瘤中央血供不足而缺氧坏死，从而诱导HIF-1α表达，调控血管生成相关因子的基因表达，促进血管生成〔18〕。肿瘤细胞缺血缺氧，诱导产生的HIF-1α还可调控多种糖代谢和糖酵解相关的酶，为细胞的快速生长提供能量〔19〕。同时，研究表明，HIF-1α在肿瘤侵袭转移和肿瘤细胞凋亡中都发挥着重要作用。在肿瘤侵袭转移方面，HIF-1α可诱导肿瘤细胞基质金属蛋白酶（matrixmetallo⁃proteinases，MMPs）的表达增加，促使胞外基质降解；还可导致上皮型钙粘素（e-cadherin，E-cad）与β链接素（β-catenin，β-cat）表达下降，使得细胞间和细胞与基质间粘附降低，肿瘤细胞得以转移。研究报道HIF-1α还可促进肿瘤细胞的凋亡，但其具体机制仍有待进一步研究。肿瘤细胞适应缺氧微环境机制的研究中还发现microRNAs与HIF-1存在相互作用，参与调节缺氧环境下肿瘤的生长〔20〕。Kulshreshtha等2007年首次报道，低氧可诱导miRNAs的表达，其启动子区域包含低氧反应元件，简称HRMs，如表达上调的miR-210、-155、-327/373和-10b〔21〕，以及表达下调的miR-20b〔22〕、miR-200b〔23〕。Kellyetal发现低氧诱导的miR-210可减少HIF-1α羟基化增加其稳定，抑制甘油3磷酸脱氢酶样1(GPD1L)；抑制E2F3和MNT（c-Myc拮抗剂）表达，加速G1/S转换，促进细胞增殖〔24〕。miR-21则靶向PTEN和激活Akt、ERK1/2信号通路，上调HIF-1α和VEGF，诱导肿瘤血管生成。因此，促进某些HRMs的表达或者通过抗转录疗法抑制某些HRMs可成为应对肿瘤细胞抗药性和抗放射性的策略及未来抗癌治疗的靶点。近期发现HIF-1α基因的单核苷酸多态性在多种癌症临床病理特征的研究有助于肿瘤的诊断。人HIF-1α基因定位在染色体14q21-24，其N-TAD基因存在两种多态性，命名为C1772T和G1790A，它们分别导致蛋白脯氨酸转变为丝氨酸，丙氨酸转变为苏氨酸〔25〕。研究表明这些变异的存在使HIF-1相比于野生型具有更高的转录活性。近期一篇Meta分析〔26〕结果表明HIF-1α基因C1772T多态性和癌症的组织学分级和淋巴结转移的增加性风险相关；G1790A多态性与较大的肿瘤大小的增加性风险和边界淋巴结转移的风险相关。因而，HIF-1α多态性可能为癌症潜在的诊断因素。结语随着在HIF-1研究的不断深入，从HIF-1mRNA转录，蛋白翻译、亚基二聚化、DNA结合活性、HIF-1转录活性方面功能予以干预，使得探究治疗缺氧性疾病的新途径逐渐成为可能。尽管在动物缺血模型和人类临床试验中HIF-1的研究有些成效,但其详尽的功能、激活途径、靶向基因及在缺氧性疾病中的具体作用机制仍未全面了解。针对HIF-1α羟化酶的研究时间甚短，不同羟化酶对其调节水平不同，何种羟化酶最为有效仍需研究。基因治疗诱导疾病中HIF-1过表达的方法，如动物实验中质粒转染或者腺病毒介导，临床应用时介导该过程的有效载体仍处于探索阶段。因而在认识HIF-1的过程中仍存在这样那样的灰色地带，未来探索之路依旧很漫长。参考文献：（略）