微生物初级考试细菌部分

/霍乱弧菌（肠道菌疾病检验—肠道属）1．概述：（1）霍乱是急性肠道传染病，剧烈的无痛性水样腹泻（2）霍乱主要由01群的古典型和ElTor型以及()139群菌株引起。（3）()1群称凝集弧菌，非()1群为不凝集弧菌。()1群依菌体中主要抗原成分A、B、C组分分为不同亚群。各称为小川型(含A、B抗原)、稻叶型（含A、C抗原）和彦岛型(含A、B、C抗原)。（4）()139群最早出现于1992年东南亚。①0139群和()1群ElTo()抗原不同；②有相同的霍乱毒素基因，对()抗原的免疫血清两者无交叉凝集，o139独特特点是：有荚膜多糖，国际标准株为M045。霍乱弧菌不侵入上皮细胞，在人的小肠内定居、增殖，释放霍乱毒素。霍乱毒素为A、B两种亚基组成，每个毒素分子A：B数量比为1：5，A又分为A1和A2，毒素酶活性部分在A1亚单位。霍乱毒素通过其B亚单位与人小肠上皮细胞上的GMl受体结合，用GMl—ELISA（酶联免疫吸附实验）可检测霍乱毒素存在。兔小肠段结扎试验也可用来检测霍乱弧菌是否产生霍乱毒素。霍乱弧菌引起的肠道局部黏膜免疫是霍乱保护性免疫的基础。针对菌体产生的抗菌免疫以及针对霍乱毒素的抗毒免疫是对霍乱免疫的因素。2．分离培养与鉴定显微镜下呈逗点状或弧形，经人工培养传代后，镜下观察呈类似大肠杆菌的杆状。庆大霉素琼脂、4号琼脂培养基为强选择性培养基，碱性琼脂、碱性胆盐琼脂等为弱选择性培养基。在庆大霉素琼脂平皿上的菌落形态：带灰色、半透明、圆形扁平稍隆起、菌落边缘湿润。河水、池塘水等外环境水进行霍乱弧菌分离，采集33．3cm以内的表层水，先用lmol/L的Na()H将水样pH值调整到8.4—9.2。碱性蛋白胨水37℃增菌6—8小时后，霍乱弧菌在培养液的上层增殖最多。碱性蛋白胨水可用作霍乱弧菌的运输保存培养基。V—P试验和第Ⅳ组霍乱噬菌体裂解试验可作为区分()1群古典型与ElTor型菌株的参考指标。对0139群霍乱弧菌，则可用特异的诊断血清。3．（噬菌体型为1～6且生物型为a至f的为流行株）对于霍乱弧菌流行株与非流行株的噬菌体—生物分型试验，最少用两平皿两试管来完成。区分流行株与非流行株的溶血试验中所用的红细胞为绵羊红细胞。溶原性测定试验中用双层琼脂法，其中上层半固体琼脂的浓度为o.7％。山梨醇发酵实验，接种pH8．0的山梨醇发酵管后37℃培养3小时。流行株对山梨醇为慢发酵。生化反应：分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、产酸不产气。迟缓发酵乳糖，不分解阿拉伯糖。氧化酶、明胶酶试验和ONA酶试验均阳性。产生靛基质，霍乱红反应（即亚硝基靛基质试验）阳性。(二)副溶血弧菌检验嗜盐性弧菌，已确定有12种不同的()抗原和约60种不同的K抗原。致病菌株能产生的耐热直接溶血素和不耐热溶血素是副溶血弧菌的主要致病物质。检验方法：（1）标本采集：患者的粪便、可疑食物。（2）分离培养：称取样品25g，加225ml3.5％灭菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，接种氯化钠琼脂平板和嗜盐再菌选择性琼脂平板各1个，同时取10ml，加入100ml增菌液中（40g/LNaCl），放37℃8～16小时培养后，进行平板分离，于37℃18—24小时培养后取出观察。（3）挑取上述可疑菌落，转种3.5％氯化钠三糖铁斜面，37℃、24小时观察结果。（4）涂片镜检：将三糖铁培养基反应可疑者(底层变黄，葡萄糖产酸不产气，斜面不变，乳糖蔗糖不分解，有动力，不产生硫化氢)进行涂片革兰染色镜检形态。①形态染色：革兰阴性杆菌，随培养基不同菌体形态差异较大，多种形态。两极浓染。菌体一端有单鞭毛，运动活泼。无芽孢、无荚膜。②培养特性：营养要求不高，在普通培养基中加入适量NaCl即能生长。最适浓度为35g/LNaCl，生长所需PH7.0～9.5，最适PH7.7。需氧，在液体培养基表面形成菌膜。在厌氧环境下生长较慢。①在35g/LNaCl琼脂平板上呈蔓延生长，菌落边缘不整齐，凸起、光滑湿润，不透明；②在副溶血弧菌专用选择培养基上形成1~2.5mm，稍隆起、浑浊、无粘性、绿色菌落；③在SS平板上不生长或长出1~2mm扁平无色半透明的菌落，不易挑起，挑起时呈粘丝状。④在羊血琼脂平板上，形成2~3mm圆形、隆起、湿润、灰白色菌落，某些菌株形成β溶血或α溶血⑤在TCBS琼脂（副溶血弧菌专用选择培养基）上不发酵蔗糖，菌落绿色。③生化反应：所有用于该菌的生化反应（副溶血弧菌）培养基需加入30g/LNaCl。本菌（副溶血弧菌）在70g/LNaCl培养基生长，在无盐或10%NaCl以上培养基不生长。能分解葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、淀粉产酸不产气，不分解乳糖、蔗糖；靛基质，甲基红试验阳，V-P、H2S、尿素酶试验阴性；致病菌株能使人或兔红细胞发生溶血，对马红细胞不溶血，称神奈川试验阳性。动物试验将上述各类反应的副溶血性弧菌接种3.5％氯化钠胨水，经37℃16～18小时培养后，小鼠腹腔注射0.3ml，观察2～3天，将死亡小鼠进行解剖并做分离培养。预防原则水产品及盐渍品等应煮熟后食用。可用复方新若明、庆大霉素、氟哌酸等抗菌药物治疗。拟态弧菌“拟态弧菌与霍乱弧菌相似——形态学、培养特性、抗原结构”引起胃肠炎和某些肠外感染。但对01群霍乱弧菌标准诊断血清不凝集，可与霍乱弧菌相鉴别。另外拟态弧菌与霍乱弧菌生化特性上最重要的区别在于拟态弧菌不发酵蔗糖（霍乱弧菌发酵蔗糖）。V-P试验、酒石酸盐及对多粘菌素B的耐药性等也可作为区别这两种弧菌的参考试验。三、肠致泻性大肠埃希菌人和动物肠道中的正常菌群，一般对人无害。革兰阴性短杆菌，其抗原结构有3种，即菌体抗原(O抗原)、包膜抗原(K抗原)和鞭毛抗原(H抗原)。临床表现为：旅游者腹泻或食物中毒。新生儿病房及托幼机构可引起交叉感染而发生流行。根据发病机制、临床表现、流行病学特征、()抗原血清型及细菌的毒力测定可将致腹泻性大肠杆菌分为5类：①肠致病性大肠杆菌EPEC的主要毒力因子有菌毛、志贺样毒素(SLTs)和LEE毒力岛。②肠产毒性大肠杆菌ETEC的主要毒力因子为热不稳定毒素、热稳定毒素及与致病性相关的定居因子。③肠侵袭性大肠杆菌EIEC在毒力因子和致病机制上与志贺菌基本一致。④肠出血性大肠杆菌EHEC的主要毒力因子有志贺样毒素(SLTs)、溶血素、LEE毒力岛及其他未知的毒力因素。⑤肠集聚性粘附大肠杆菌(EAggEC)是一类新发现的致泻性大肠杆菌，目前已知的毒力因子有菌毛和热稳定肠毒素。主要与小儿顽固性腹泻有关。4．鉴别诊断EPEC引起肠炎鉴别诊断：①痢疾②沙门菌肠炎③空肠弯曲菌肠炎④病毒性肠炎⑤幼儿急疹等。ETEC：主要①霍乱，其次②病毒性肠炎③沙门菌肠炎。EIEC：细菌性痢疾，确定诊断：EIEC血清凝集试验阳性及大便培养所得的大肠杆菌作豚鼠角膜试验阳性。致泻大肠埃希菌检验一、增菌样品采集后应尽快检验。除了易腐食品在检验之前应预冷藏外，一般不冷藏。无菌称取检样25g，加在225ml营养肉汤中，以均质器打碎1分钟或用乳钵加灭菌砂磨碎。取出适量，接种乳糖胆盐培养基，测定大肠菌群MPN，其余的移人500ml广口瓶内，于36℃土1℃培养6小时。挑取l环，接种于1管30ml肠道菌增菌肉汤内，于42℃培养18小时。二、分离将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板；污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平板，于36℃±1℃培养18～24小时，观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。三、生化试验1、自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁琼脂(TSI)或克氏双糖铁琼脂(KI)。同时将这些培养物分别接种蛋白胨水、半固体、pH7．2尿素琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。以上培养物均在36℃培养过夜。2．TSI（三糖铁琼脂）斜面产酸或不产酸，底层产酸，H2S阴性，KCN阴性和尿素阴性的培养物为大肠埃希菌。底层不产酸，或H2S、KCN、尿素有任意一项为阳性的培养物，均非大肠埃希菌。必要时做氧化酶试验和革兰染色。四、血清学试验假定试验+证实试验四、沙门菌属(一)病原学：寄生人类和动物肠道中，生化反应和抗原构造相似的革兰阴性杆菌。目前至少有67种()抗原和2000个以上的血清型，仅少数对人致病①肠热症的伤寒②副伤寒③甲和乙沙门菌其他对动物致病，偶可传染给人，引起食物中毒或败血症，如①鼠伤寒沙门菌（最常见）、②肠炎沙门菌、③鸭沙门菌、④猪沙门菌等沙门菌属除鸡沙门菌和雏沙门菌，都有周身鞭毛。一般无荚膜。营养要求不高，在普通平板上形成中等大小、五色半透明的S型菌落。沙门菌属不发酵乳糖或蔗糖。大多产生硫化氢。对葡萄糖、麦芽糖和甘露醇发酵，除伤寒沙门菌产酸不产气外，其他沙门菌均产酸产气。IMViC○1伤寒沙门菌(一十一一)、○2甲型副伤寒沙门菌(一十一一)、○3乙型副伤寒沙门菌(一十一V)和○4鼠伤寒沙门菌(一十一V)。生化检验主要用于菌属鉴别。伤寒沙门菌与大肠埃希菌在糖发酵方面的主要差别之一在于伤寒沙门菌不分解乳糖。对沙门菌的选择分离培养可用SS琼脂，在SS琼脂上其菌落呈现微黄色或无色。在发病早期(一般l周内)可从血液中分离，此时从血液中的分离率最高；l周后粪便或尿中，发病第3周时粪便标本病原分离率最高；骨髓培养是细菌学确诊的最好方法，在发病第1周时也较高，检出率可达到90％以上。胆汁标本也可以进行分离。沙门菌属具有分类诊断意义的3类抗原：○1O抗原、○2H抗原和○3K抗原，另外K抗原又有两种，即○1Vi抗原和○2M抗原O抗原系耐热性菌体抗原，由多糖—磷脂复合物组成；H抗原系不耐热抗原，存在于鞭毛中，由鞭毛素组成；K抗原存在于荚膜或被膜中，其中Vi抗原是覆盖在细菌细胞壁LPS（脂多糖）外的荚膜多糖抗原。伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌具有Vi抗原。沙门菌的抗原变异，对菌型诊断及在制备菌苗上有重要意义，变异的类型○1H—O、○2S-R、○3V-W变异和位相变异。肥达试验为用已知的伤寒沙门菌O、H和甲、乙型副伤寒沙门菌H抗原与不同稀释度的待检血清作定量凝集试验，根据抗体的含量和动态变化以辅助临床诊断伤寒病原菌的一种血清学试验。在病起的第2周，血清中抗体就可有较明显增多，恢复期达到高峰。一般()凝集价≥l：80，H凝集价≥l：160时才有诊断价值，有时单次效价增高不能定论，病程中应逐周复查，若效价依次递增或恢复期效价增加≥4才有意义。IgM类O抗体出现较早，持续约半年，消失后不易受伤寒等病原菌的非特异性抗原刺激而重新出现。IgG类H抗体出现较晚，维持时间长达数年，消失后易受非特异性抗原刺激而能短暂重现。因此若O、H凝集效价均超过正常值，则伤寒或副伤寒感染的可能性大；如两者均低，则患伤寒的可能性甚小；若O不高H高，可能是预防接种或非特异性回忆反应；如O高H不高，可能是感染早期或与伤寒沙门菌O抗原有交叉反应的其他沙门菌(如肠炎沙门菌)。少数病例，在整个病程中，肥达试验始终在正常范围内，可能是早期使用大量抗生素，或患者免疫功能低下等因素。预防“三管一灭’’(管水、管食物、管粪便和消灭苍蝇)，防止水源和食品污染。伤寒疫苗为Vi疫苗。（五）实验室：沙门菌检验1、前增菌和增菌冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。2、分离取增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板和一个DHL琼脂平板(或HE、WS、LS)。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。36℃±1，18～24小时(DHL、HE、WS、SS)或40—48小时(BS)，观察各个平板上生长的菌落特征。3、生化试验（1）．自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂。在三糖铁琼脂内，肠杆菌科常见属种的反应结果不同。○1在三糖铁琼脂内只有斜面产酸并同时硫化氢(H2S)阴性的菌株可以排除，其他的反应结果均有沙门菌的可能，同时也均有不是沙门菌的可能。（2）、在接种三糖铁琼脂的同时，再接种蛋白胨水(供作靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各1管，于361℃±1培