微生物制药.

第二章微生物制药一、微生物药物的几个相关基本概念二、微生物药物的分类三、微生物药物的应用四、药源微生物及微生物药物的筛选技术五、微生物药物的发酵生产技术六、微生物药物的分离、精制和鉴别七、废弃物的综合利用和环境保护四、药源微生物及微生物药物的筛选技术（一）药物的产生菌（二）新药产生菌的分离（三）新微生物药物的筛选（四）微生物药物产生菌的菌种改良（五）微生物药物产生菌的保藏（三）新微生物药物的筛选1、初筛发酵初筛发酵是能否产生抗生素的关键，需要选择适合的发酵培养基和培养条件，以利于抗生素的合成。培养基主要是供给微生物生长和合成抗生素的材料。培养基成分碳源糖类、脂肪、某些有机酸、醇或碳氢化合物供给微生物生命活动所需要的能量以及构成菌体细胞成分和代谢产物。氮源蛋白胨、黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆、肉膏、酒泥硫酸铵、氨水、硝酸盐等供给微生物生长所需的氮素，构成菌体原生质无机盐、微量元素磷、镁、钾、钠等铁、铜、锌、锰、钴、钼等可以作为生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物初筛方式：固体平板发酵——液体振荡培养——便于大量筛选抗菌物质时采用。放线菌大都为好氧菌，增加溶解氧有利于放线菌生长和抗生素的合成。2、筛选模型的研究与应用10000株新分离的放线菌30株（可能是新抗生素）10种新化合物1种有希望的化合物，低毒性，体内有效新抗生素/分离的菌株数：1/1000新抗生素/已知抗生素：1/50有希望的抗生素/分离的菌株数：1/100002500株对细菌有抗菌活性500株250株链丝菌素类125株链霉素类40株四环素类55株其他已知抗生素交叉耐药试验和纸层鉴别Woodruff等的经典筛选毒性试验（1）常规的筛选方法琼脂扩散法——利用多种微生物作为检定菌，筛选有抗菌活性的物质。非致病菌抗生素耐药突变株和超敏菌株厌氧菌协同活性检测（2）定靶筛选从临床有效的抗生素的作用机理和细菌的耐药机理来设计筛选模型，有目的地筛选具有某种作用机理的抗生素，试图获得抗菌作用强、对耐药菌有效、毒性小的新抗生素。以作用机理为依据的筛选方法以耐药机制为依据的筛选方法细菌细胞壁合成抑制剂的筛选土壤分离的微生物（10200株）（细菌、真菌和放线菌）第二步：测定抑制同位素渗入meso-[3H]二氨基庚二酸L-[14C]亮氨酸用DiafloUM-2膜测定相对分子质量（1000以下）小分子量：azureomycinA和B（新）AM-1034AM-5289Amphomycin，青霉素G大分子量：ristocetinA和B其他（11种）+-+-++（487）（238）（1530）+-+-++第一步：抗微生物活性：细菌支原体细胞壁合成抑制剂（141）asukamycinSetomimycinvineomycinsnanaomycinA、B、C、D、EfreonolicinBcervinomycins其他以耐药机制为依据的筛选方法抗生素的广泛使用和一些不合理的滥用，引起细菌耐药性的增加，而细菌耐药机制的研究进展又使耐药性的解决成为可能。细菌的耐药机制主要有4种：A.细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解或修饰进入细菌细胞内的抗生素，使之失去生物活性；B.抗生素的作用靶点由于发生突变或被细菌的某种酶修饰而使抗菌药物无法发挥作用，以及抗生素作用的靶酶的结构发生改变使之与抗生素的亲和力下降；C.由于细菌细胞膜渗透性的改变或其他有关特性的改变；D.细菌具有一种依赖于能量的主动转运机制，它能够把进入胞内的药物泵至胞外。β-内酰胺酶抑制剂的筛选β-内酰胺酶是一类能够破坏具有β-内酰胺结构抗生素的钝化酶的总称。许多致病菌由于产生β-内酰胺酶而对青霉素和头孢菌素具有抗性。β-内酰胺酶抑制剂的筛选主要依据抑制剂抑制β-内酰胺酶，使酶失去活性，不能水解β-内酰胺类抗生素，使抗生素保持生物活性，从而抑制细菌生长繁殖。耐药菌株平板法液体测定法联合使用β-内酰胺酶以及敏感和耐药突变株通过颜色变化来检测β-内酰胺酶抑制剂诱导β-内酰胺酶方法的应用3、高通量筛选高通量筛选（highthroughputscreening）技术是20世纪80年代后期形成的寻找新药的高新技术。将许多模型固定在各自不同的载体上，用机器人加样，培养后用计算机记录结果，并进行分析，可以实现大规模的筛选。高通量筛选的模型：细胞模型——观察待测样品对细胞的作用，反映药物对细胞生长等过程的综合作用。包括各种正常细胞和病理细胞。分子模型——包括受体、酶等，药物作用的靶点明确。其他模型现阶段的微生物药物筛选主要研究方面：a)产生菌的来源b)微生物的初筛发酵c)新的筛选模型和方法四、药源微生物及微生物药物的筛选技术（一）药物的产生菌（二）新药产生菌的分离（三）新微生物药物的筛选（四）微生物药物产生菌的菌种改良（五）微生物药物产生菌的保藏•目的——将产生菌的一些有益变异，通过不断的筛选和培育，为研究和生产提供更多合乎需要的高产优质新菌种。（四）微生物药物产生菌的菌种改良自然选育诱变育种杂交育种基因工程技术改良菌种1、自然选育在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程，叫做自然选育或自然分离。自然选育包括从自然界分离获得菌株根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌种。1）从自然界分离获得菌株一般包括以下几个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定等。调查研究（包括资料查阅）↓试验方案设计↓采样↓第一次增殖培养↓第一次平板分离↓第二次增殖培养↓第二次平板分离↓第二次原种斜面↓初筛（1株1瓶）增殖条件摸索→第一次原种斜面→←定性或半定量测定第三次平板分离↓第三次原种斜面↓复筛（1株3-5瓶）↓第四次平板分离↓第四次原种斜面↓再复筛↓较优化菌株1-3株初步工艺条件摸索→→第三次原种保藏←种子培养不纯保藏及进一步做生产性能试验或作为育种的出发菌株某些必要试验和毒性试验等2）从自发突变体中获得菌株变异是育种的基础。自然突变是指自然条件下出现的基因变化。自发突变的频率较低，因此自然选育筛选出来的菌种，不能满足育种工作的需要。因而不能仅停留在“选”种，还要进行“育”种。如通过诱变剂处理菌株，就可以大大提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株——诱变育种。2、诱变选育人工诱变能提高突变频率和扩大变异谱，具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。诱发突变随机性大，必须与大规模的筛选工作相配合才能受到良好的效果。诱变育种的主要环节：①以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的微生物细胞悬浮液（细胞或孢子）以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中DNA碱基变异频率大幅度提高；②用合适的方法淘汰负效应变异株，选出极少数性能优良的正变异株，以达到培育优良菌株的目的。a.出发菌株的选择b.菌悬液的制备c.前培养d.诱变e.变异菌株的分离和筛选1）诱变剂物理诱变剂化学诱变剂生物诱变剂各种射线，如紫外线、X射线、β射线、γ射线、α射线和超声波等乙基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍、亚硝酸、氮芥等。噬菌体、转座因子防护面罩防护衣防护罩各种化学诱变剂常用的剂量和处理时间诱变剂诱变剂的剂量处理时间缓冲剂中止反应方法亚硝酸（HNO2）0.01～0.1mol/L5～10minpH值4.5，1mol/L醋酸缓冲液pH8.6，0.07磷酸二氢钠硫酸二乙酯（DES）0.5～1％10～30min，孢子18～24hpH值7.0，0.1mol/L磷酸缓冲液硫代硫酸钠或大量稀释甲基磺酸乙酯（EMS）0.05～0.5mol/L10～60min，孢子3～6hpH值7.0，0.1mol/L磷酸缓冲液硫代硫酸钠或大量稀释亚硝基胍（NTG）0.1～1.0mol/mL，孢子3mg/mL15～60min，90～120minpH值7.0，0.1mol/L磷酸缓冲液或Tris缓冲液大量稀释亚硝基甲基胍（NMU）0.1～1.0mol/mL15～90minpH值6.0～7.0，0.1mol/L磷酸缓冲剂或Tris缓冲液大量稀释氮芥0.1～1.0mol/mL5～10minNaHCO3甘氨酸或大量稀释乙烯亚胺1:1000～1:1000030～60min硫代硫酸钠或大量稀释羟胺（NH2OH∙HCl）0.1～0.5％数小时或生长过程中诱变大量稀释氯化锂（LiCl）0.3～0.5％加入培养基中，在生长过程中诱变大量稀释秋水仙碱（C22H25NO6）0.01～0.2％加入培养基中，在生长过程中诱变大量稀释2）影响诱变效果的因素①出发菌株的遗传特性；②诱变剂；③菌种的生理状态；④被处理菌株的预培养和后培养条件；⑤诱变处理时的外界条件等。a)选择合适的出发菌株b)采用分散状态的孢子悬浮液处理c)采用单核细胞（或核质体）处理d)注意微生物的生理状态e)适宜的诱变剂量3）筛选的方法制定筛选方案方案设计的中心内容是确定诱变筛选流程。出发菌种（砂土管或冷冻管）↓斜面→或肉汤培养24h↓单孢子悬液↓诱变处理↓稀释涂布平板↓挑取单菌落传种斜面↓菌悬液诱变处理——处理前后的孢子液或细菌悬液作活菌计数并统计其存活率——观察单菌落形态并统计其形态变异率摇瓶初筛↓挑出高产斜面↓菌种保藏（砂土管、冻干管或制备固体孢子）↓摇瓶复筛（复筛次数及摇瓶数以及培养基种类根据情况决定）↓挑出高产菌株作稳定性试验和菌种特性考察↓放大试验罐、中试考察↓大型投产试验传种斜面（或直接用固体孢子）——对照组——对照组突变株的筛选方法一般经诱变后，再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等。淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。营养缺陷型菌株的检出方法有：逐个测定法、夹层平板法、限量营养法和影印接种法等。影印平板（Replicaplating）法是Lederberg夫妇在1952年建立用梯度平板法定向培育若干代谢产物的高产菌株代谢产物产生菌抗代谢物肌苷Bacilluspumilus（短小芽胞杆菌）8-氮鸟嘌呤肌苷Corynebacteriumsp（一种棒状杆菌）6-硫鸟嘌呤腺嘌呤Salmonellatyphimarium（鼠伤寒沙门氏菌）2，6-二氨基嘌呤烟碱酸Chlamydomonaseugametos（一种衣藻）3-乙酰吡啶色氨酸Salmonellatyphi（伤寒沙门氏菌）6-甲基色氨酸甲硫氨酸Escherichiacoli（大肠杆菌）乙硫氨酸酪氨酸E.coli对氟苯丙氨酸吡咯叠氮（pyrrolnitrin）Pseudomonasaureofaciens（金色假单胞菌）6-氟色氨酸亮氨酸S.typhi三氟-DL-亮氨酸根据形态变异淘汰低产菌株，根据平皿反应挑取高产菌株。摇瓶筛选法琼脂块筛选法筛选自动化和筛选工具微型化①随机筛选②理性化筛选运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成产物的高产突变株。理性化筛选初级代谢产物高产菌株的筛选：a.降低终产物浓度b.筛选抗反馈突变菌株次级代谢产物（主要是抗生素）高产菌株的筛选：a.利用营养缺陷型筛选b.筛选负变株的回复突变株c.筛选去磷酸盐调节突变株d.筛选去碳源分解代谢调节突变株e.筛选氨基酸结构类似物抗性突变株f.筛选二价金属离子抗性突变株g.筛选前体或前体结构类似物抗性突变株h.筛选自身所产的抗生素抗性突变株降低终产物浓度杂交育种——一般指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合，使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。真菌、放线菌和细菌均可进行杂交育种。3、杂交育种1）常规的杂交育种a)遗传标记b)异核体形成c)杂合二倍体的形成d)染色体交换和单倍体2）原生质体融合A.标记菌株的筛选供融合用的两个亲株要求性能稳定并带有遗传标记，以利于融合子的选择。采用的遗传标记一般以营养缺陷型和抗药性等遗传性状为标记。通过采用多种抗生素及其他药物，以梯度平板法进行粗选，再用具有抗性的抗性生物制备不同浓度的平板，进行较细的筛选。B.原生质体的制