微生物检验第九章分枝放线菌.

分枝杆菌放线菌诺卡菌•Mycobacterium是一类细长略带弯曲的杆菌，含有分枝菌酸，有分枝生长的趋势而得名。具有抗酸性，故又称抗酸杆菌(acid-fastbacillus)。人结核分枝杆菌牛分枝杆菌非洲分枝杆菌第一节结核分枝杆菌荚膜：CR3结合、降解大分子物质、保护、抑制溶酶体融合脂质：索状因子、磷脂、硫酸脑苷脂、蜡质D蛋白质:超敏反应、结核结节的形成传播途径：呼吸道、消化道、损伤的皮肤疾病：多种脏器的结核病，肺结核最为多见。免疫性：高感染率，低发病率。抗体无保护作用带菌免疫细胞免疫细长略带弯曲的杆菌，抗酸染色后结核分枝杆菌呈红色，背景呈蓝色。菌体外有荚膜。专性需氧改良罗氏培养基生长缓慢表面干燥、不透明的菜花样粗糙型菌落液体培养时生成菌膜•抵抗力较强。耐干燥，在干燥的痰内生存6～8个月，对化学消毒剂的抵抗力较强，在3％HCl或6％H2SO4中不被杀死，对湿热敏感,在70％～75％乙醇中数分钟即被杀死。•结核分枝杆菌不发酵糖类，有毒株中性红试验均阳性，无毒株则为阴性，并失去索状生长现象。H2O2烟酸硝酸盐人型结核分枝杆菌+++牛型结核分枝杆菌+--（1）DirectSmear2.MorphologicExaminations报告标准-全视野未找到抗酸菌1+100个视野发现3～9个2+100个视野发现10～99个3+每个视野发现1～9个4+每个视野发现10个以上（2）浓缩集菌涂片检查法如果直接涂片镜检不易检出结核杆菌，应采用浓缩集菌涂片检查法，以提高结核杆菌的检出率。将标本离心，取沉淀涂片，或采用漂浮集菌法，集菌后标本经反复多次使涂层加厚，一般取3~4个接种环，干燥固定后染色镜检。3.核酸检测用PCR法快速诊断结核分枝杆菌感染,特异性与敏感性均大于95％。４.抗原检测：用ELISA法检测结核分枝杆菌抗原，可快速得知是否感染结核分枝杆菌．５.抗PPDIgG的检测用ELISA法检测患者血清中抗PPDIgG，可作为活动性结核分枝杆菌感染的快速诊断方法，阳性率为80％～90％。６.分离培养专性需氧、罗氏培养基、8w前处理•目的：去除杂菌，痰液均质化。•方法：挑取5ml痰液至已经标记的50ml离心试管中；加入等量的2%N-乙酰半胱氨酸-氢氧化钠（NACL-NaOH）前处理液（去污染）；漩涡振荡20秒；静置15分钟，切勿超过20分钟；加入无菌PBS（PH6.8）至约50mL，盖紧盖子；离心3000r/min，15分钟；倒掉上清液；添加1-3mlPBS（PH6.8）以中和PH至6.8.•无菌毛细管吸取消化后标本0.1ml，滴加于中性罗氏培养基，将接种过的斜面来回晃动，使菌液均匀铺于斜面上，斜面朝上放37℃恒温箱内培养。每一标本同时接种2支。•接种后第一周每天观察一次，此后每周观察一次。阳性结果经涂片证实随时报告。若7天内报告阳性，则为快速生长菌，超过7日则为缓慢生长菌。阴性结果至8周报告。必要时可延长。７.鉴定(1)PCR反向膜探针杂交ELISA法(PCR杂交梳)(2)DNA探针(3)16srRNA基因序列测定(4)高效液相色谱(HPLC)检测８.药物敏感性试验将纯培养物菌悬液，接种含各种浓度药物的固体培养基上，同时做不含药物的对照组。经过培养，含有药物的培养基上菌落数目是对照组的75％以上，则认为该菌对该药物浓度为完全耐药，如无菌落生长则为敏感。四、免疫学诊断1、结核菌素试验原理：纯蛋白衍生物(PPD)，是用三氯醋酸沉淀结核菌培养滤液后的纯化物。注入皮内后如受试者已感染结核，则结核菌素与致敏淋巴细胞特异性结合，形成迟发型超敏反应性炎症。•应用：①选择BCG接种对象及测定接种效果，结核菌素反应阴性者应接种BCG；②结核菌素试验对婴幼儿可做诊断结核病之用；③在末接种BCG的人群中作结核分枝杆菌感染的流行病学调查；④可借用其测定肿瘤病人的细胞免疫功能。•2、结核分枝杆菌抗原检测•3、结核分支杆菌抗体检测•4、全血干扰素释放试验ESAT、CFP-10第二节非典型分枝杆菌指结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌。因具有抗酸性，故又称非典型抗酸性菌。广泛分布于外环境和人及动物的机体中。已发现50种以上能引起人类疾病，引起的肺部感染。特点•1、对人类的致病性比MTB低。•2、机体免疫力低下时作为继发性疾病发生。•3、与结核分支杆菌发生混合感染•4、对抗结核药物天然耐药光产色分枝杆菌暗产色分枝杆菌不产色分枝杆菌迅速生长分枝杆菌—、光产色分枝杆菌特点是在暗处不产生色素，光照1h后能在48h内，菌落转为黄色或橘黄色。对人有致病性的是：1．堪萨斯分枝杆菌广泛分布于水和土壤中，能引起肺内外结核样的病变。2．海分枝杆菌为水中的腐生菌。通过皮肤微小创口侵入，引起所谓的“游泳池肉芽肿”。3．猿分枝杆菌先后从猿和人体分离出此菌。二、暗产色分枝杆菌有光或无光均能产生色素，呈黄色或橘黄色。对人有致病性的为：1．瘰痢分枝杆菌25℃-37℃均可生长，35℃最为适宜，45℃则不能生长。可引起人淋巴结炎或肺部感染。2．斯氏分枝杆菌37℃时为暗产色，25℃时为光产色。本菌引起成人肺部的慢性感染。三、不产色分枝杆菌不能产生色素。对人有致病性的是：1．鸟-胞内复合分枝杆菌(MAC/MAIC)AIDS患者易感染，对抗结核药物不敏感或产生耐药。2．溃疡分枝杆菌通过创伤感染，四肢伸侧形成无痛性溃疡，缓慢愈合或出现继发感染。3．蟾蜍分枝杆菌为蟾蜍肉芽肿的病原菌。多引起老年男性的慢性肺部感染。四、迅速生长分枝杆菌在普通培养基上生长速度快，生长温度为25℃-45℃，对人有致病性的是：1．偶发分枝杆菌可引起人局部或肺部感染，对现有的抗结核药物均有耐药性。2．龟分枝杆菌可引起人的软组织病变及手术后继发感染，亦可引起肺部感染。第三节麻风分枝杆菌麻风病的病原菌，麻风是一种慢性传染病，主要表现为皮肤、粘膜和神经末梢的损害。晚期可侵犯深部组织和器官，形成肉芽肿。根据临床表现、免疫病理变化和细菌检查结果等将麻风分为瘤型、结核样型和界限类综合征等三种病型。抗酸杆菌，呈束状或团状排列，G+无鞭毛、荚膜和芽胞。麻风分枝杆菌为典型的胞内寄生菌，有该菌存在的细胞胞质呈泡沫状称麻风细胞．用药后细菌可断裂为颗粒状、链杆状等，着色不均匀，叫做不完全菌。微生物学检验显微镜检查：在镜检时应注意与结核分枝杆菌杆菌形态相鉴别．麻风分枝杆菌多呈束状或成团聚集．结核分枝杆菌多散在．麻风分枝杆菌菌体粗直，两端尖细，而结核分枝杆菌则细长略弯曲且有分枝现象．活组织切片：抗酸染色及病理学检查放线菌属与诺卡菌属•主要致病菌——衣氏放线菌（A.israelii)•属于正常菌群。在机体抵抗力减弱、口腔卫生不良、拔牙或外伤时引起内源性感染，导致软组织的化脓性炎症。若无继发感染则大多呈慢性无痛性过程，并常伴有多发性瘘管形成，排出黄色硫磺样颗粒，此即为放线菌病。最为常见的是面颈部感染。放线菌属致病性与免疫性放线菌：正常菌群所致疾病：1.内源性感染(放线菌病)：软组织肉芽肿性炎症(慢性,无痛,多发性瘘管,排出硫磺样颗粒)2.龋齿和牙周炎免疫性：细胞免疫–G+、非抗酸性丝状菌–培养困难，厌氧或微需氧–硫磺样颗粒（菌落）压片或组织切片，显微镜下可见颗粒呈菊花状生物学性状硫磺样颗粒(sulfurgranule)培养：厌氧或微需氧气体环境：5％CO2营养培养基：脑心浸液琼脂平板温度与时间：37℃，24～48h菌落:灰白色蜘蛛状、不规则结节状或臼齿状菌落,初分离(粗糙)生化特性:溶血(-)葡萄糖(+)甘露醇(+)吲哚(-)过氧化氢酶试验(-)微生物学检查主要：硫磺样颗粒（脓汁,痰,分泌物）有颗粒：压片镜检:菊花状排列的菌丝无颗粒：分枝菌丝，断裂的菌细胞必要：厌氧培养（缓慢，37℃培养2w以上）诺卡菌属1.需氧2.含分枝菌酸3.分布：土壤中，多数：非致病菌4.致病菌：星形诺卡菌（N.asteroides）巴西诺卡菌（N.brasiliensis）豚鼠诺卡菌（N.caviae）生物学性状形态：与以色列放线菌相似革兰染色：阳性抗酸染色：阳性脱色时间延长阴性(与TB区别)硫磺样颗粒:渗出液、痰或脓汁中有时可见淡黄、红色或黑色小颗粒。营养要求：不高（沙氏或普通琼脂培养基）气体环境：需氧，有气生菌丝培养温度：室温或37℃生长速度：缓慢生长，约1周色素：星形诺卡菌：黄色或深橙色，无白色菌丝巴西诺卡菌：有白色菌丝菌丝断裂：5天后镜检可见链球状或链杆状（放线菌属：24h开始)培养特征：菌落：有皱褶、颗粒状致病性侵入途径：呼吸道或皮肤创伤所致疾病：诺卡菌病（nocardiosis）外源性感染化脓性感染肺部：肺炎、肺脓肿、肺空洞脑部：脑脓肿、脑膜炎其他：肾、肝、脾、心包等（慢性肉芽肿，瘘管）好发于免疫缺陷患者微生物学检查1.硫磺样颗粒压片2.取痰、脑脊液、脓汁：涂片革兰染色及抗酸染色3.分离培养：沙保弱或普通琼脂培养基4.生化试验血琼脂平板菌落呈黄色或深橙色革兰染色阳性球杆菌菌丝（培养后期）弱阳性抗酸染色阴性诺卡菌属、链霉菌属等其他细菌