悬浮聚合聚丙烯酰胺载体固定化酶特性的研究12.1

悬浮聚合聚丙烯酰胺固定化酶特性的研究龚伟中1，2魏甲乾2（1.中国科学院兰州化学物理研究所,甘肃兰州730000，2.甘肃省科学院生物研究所，甘肃兰州730000）接要：本研究以悬浮聚合聚丙烯酰胺为载体材料，采用包埋—交联法固定化葡萄糖淀粉酶，并对其特性进行了研究。实验表明丙烯酰胺悬浮聚合固定化糖化酶的方法是简便可行的。关键词：聚丙烯酰胺固定化葡萄糖淀粉酶包埋—交联法StudyofGlucoamylaseimmobilizedonpolyacrylamidegelusingsuspensionpolymerizationanditsspecialityGONGWei-Zhong1,2WEIJia-Qian2(1.InstituteofChemistryandPhysics,ChineseAcademyofSciences,Lanzhou730000)1(2.InstituteofBiology,GansuAcademyofSciences,Lanzhou730000)2Abstract：Inthispaper,Glucoamylaseimmobilizedontopolyacrylamidegelusingentrapment-crosslinkingthroughsuspensionpolymerization,andwestudythespecialityofimmobilizedGlucoamylase.Resultshowedthattheimmobilizedenzymemethodisverysimplyandfeasible．Keyword：polyacrylamidegel，immobilizedGlucoamylase，entrapment-crosslinking0引言：近年来对固定化酶技术研究很多，并已取得长足的进步，先后开发了许多固定化方法和性能多样的材料[1-3]，但是真正投入工业化应用的固定化酶不多，主要原因是固定化成本高、效率低，稳定性相对较差，因此，必须开发出更简便更实用的固定化方法以及新型的功能性材料，以拓展固定化酶制剂在多种工业生产中的应用。聚丙烯酰胺载体无毒无味，耐酸碱，强度好，通过廉价易得的丙烯酰胺悬浮聚合[4-5]，可得到颗粒状很细的聚丙烯酰胺载体颗粒，经过包埋-交联法固定化酶，有利于提高固定化酶活性和稳定性。本文就悬浮聚合聚丙烯酰胺固定化葡萄糖淀粉酶的特性进行了探讨研究，以期为该酶在淀粉工业中应用作初步尝试。1.实验部分1.1材料：丙烯酰胺（CP，中国医药集团上海化学试剂公司）,N，N′亚甲基双丙烯酰胺（CP，中国医药集团上海化学试剂公司）,过硫酸钾（AP，北京化工厂）,三氯甲烷（AP，天津化学试剂有限公司）,甲苯（AP，天津化学试剂有限公司）,二甲氨基丙腈（实验试剂，上海试剂三厂）,碳酸氢钠（AP，北京化学试剂公司）,戊二醛溶液（生化试剂，天津市医药公司），其它试剂均为分析纯和化学纯。1.2仪器：水浴锅，砂心漏斗，搅拌装置一套（搅拌棒、温度计、铁架台等）等1.3方法：1.3.1糖化酶的固定化：分别取甲苯290ml，氯仿110ml置于500ml容瓶中（甲苯：氯仿290:110），将一定量的糖化酶溶解在PH4.6的缓冲液中，以4层纱布过滤到小烧杯中，同时，将一定量的丙烯酰胺溶解在缓冲溶液中，再将一定量N，N′亚甲基双丙烯酰胺溶解在缓冲溶液中（稍加热10多分钟），然后将三者混合，分别在混合液中加入二氨基丙腈和过硫酸钾，一起装入带搅拌器的三颈瓶中，在20-40℃的水浴中反应1小时，同时向三颈瓶中通入一定压强的N2作为保护气，结束后将固定化糖化酶分别用缓冲溶液，碳酸氢钠溶液洗涤，再用戊二醛溶液交联处理，充分洗涤后置于冰箱中备用。1.3.2酶活测定1.3.2.1酶活的定义：1g固体酶于40℃，pH4.6的条件下，1h分解淀粉产生1mg葡萄糖，即为1个酶活单位，以u/g或u/ml表示。1.3.2.2糖化酶活力的测定：见文献[4]。1.3.2.3固定化糖化酶活力测定：准确称取1g固定化糖化酶干载体颗粒于40℃，pH4.6的条件下，1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，即为1个酶活单位，以u/g·gel表示2.结果与讨论：2.1固定化糖化酶的制备2.1.1给酶量对固定化酶活力的影响在合成载体的材料的量一定的条件下，对不同量的糖化酶进行固定，通过实验发现当加入酶的量为1g时，得到的固定化酶酶活回收率较高。见表12.1.2交联剂对固定化酶活力的影响戊二醛含有2个醛基，能够与酶分子之间形成共价键，得到三维交联的网状结构。表1为固定化酶经过戊二醛交联处理后的结果。表1.固定化糖化酶的处理Table1.Treatmentofimmobilizedglucoamylase加酶量/(g/20g.gel)处理与否表观酶活/(u/g.gel)酶活回收率/(%)0.5未处理65.6513.10.5处理251.69511未处理19.15--1处理265.3753由表中可以看出，固定化酶经过戊二醛交联处理后酶活性有较大幅度的提高。2.2固定化糖化酶的特性研究2.2.1pH值的影响称取一定量的固定化酶和游离酶，在pH3.0、4.0、5.0、6.0和7.0的2%可溶性淀粉溶液中，40℃下反应40分钟，然后测其剩余酶活，结果如图1所示；00.20.40.60.811.234567pH值相对酶活固定化酶游离酶00.20.40.60.811.204045505560温度℃相对酶活固定化糖化酶游离酶图1.固定化糖化酶的最适pH值FIG.1OptimalreactionpH-valueofimmobilizedGlucoamylase图2.固定化酶的最适反应温度FIG2OptimalreactiontemperatureofimmobilizedGlucoamylase由图中可以看出固定化酶在pH5左右时有较高酶活性，而游离酶在pH4～4.5时有较高的活性，这可能取决于H+的分布，聚丙烯酰胺带负电，在其周围集中了H+，使固定化酶所处的反应区域的pH值较周围反应液低，为了得到固定化酶的最适pH值，外部填充相的pH值必须低于游离酶的固有pH值。因此，pH值向碱性方向偏移，而使得固定化酶的最适pH值升高1个单位。2.2.2最适温度取一定量的固定化酶和游离酶，在最适pH条件下，以2%的可溶性淀粉溶液为底物，于40～70℃的温度范围内，反应30～60min，然后测定残余酶活，结果如图2所示。由图中可以看出，固定化酶的最适作用温度在55℃～58℃,与游离酶的最适反应温度相近，而且固定化酶在较宽的温度范围内保持较高的催化活性。2.2.3米氏常数Km的测定取一定量的固定化酶和游离酶,在最适pH和温度条件下，以不同浓度的淀粉溶液为作用底物，测定酶活，然后做Lineweaver-Burk双倒数曲线图，结果见图3所示。00.511.522.533.54-200-1000100200300400500[1/s]1/v固定化糖化酶游离酶图3.固定化酶Lineweaver-Burk双倒数曲线图Fig.3LineWeaver-Burkplotfordeterminareofkmvalueforfreeandimmobilizedglucoamglase游离酶和固定化酶的动力学研究显示，固定化酶的米氏常数Km增加了倍，这表明固定化酶对底物的亲和力降低，动力学常数的变化归咎于酶周围的微环境的改变。这可能是固定化酶经交联处理后形成的共价键降低了底物与酶活性部位的结合。2.3固定化糖化酶的稳定性研究2.3.1对温度的稳定性取一定量的固定化酶和游离酶，在不同温度30、40、50、60和70℃下，于pH4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液中保温30～60min后，在40℃下测定酶活力，实验结果表明固定化酶在70℃时相对酶活为75%，而游离酶却为35%。说明固定化酶对温度的稳定性较游离酶高。2.3.2固定化酶贮存稳定性和操作稳定性将固定化酶置于0℃～4℃冰箱中，在无底物存在下，保存8个月，每一个月测一次酶活，结果显示未出现明显的失活现象，8个月后固定化酶的残余活力仍保持在94%左右。如图5所示。固定化酶经过2批次的循环使用后（55℃和pH4.6），第1批后酶活损失较大，再经过多次的操作（2～8批），固定化酶活性损失较小，剩余酶活几乎保持在70%左右，显示出良好的操作稳定性，结果如图6所示。图3固定化糖化酶对温度的稳定性00.20.40.60.811.23040506070t/℃相对酶活固定化糖化酶游离酶00.20.40.60.811.2012345678时间(月)残余酶活00.20.40.60.811.20246810操作批次残余酶活图5固定化糖化酶的贮存稳定性FIG.5Storestabilityofimmobilizedglucoamylase图6固定化酶的操作稳定性FIG.6.Operationalstabilityofimmobilizedglucoamylase3结论参考文献1.徐云兰，杨明莉，辛龙涛等。糖化酶固定化研究.1999，12（3）：41-432.钱军民，张兴，吕飞等。酶固定化载体材料研究新进展.2002，30（10）：21-243.梨刚，固定化技术进展.2002，22（5）：45-484.姜锡瑞.酶制剂应用手册.北京：中国轻工出版社，1999，286-289.5.6.7.8.