巢式PCR实验原理

巢式PCR巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应（PCR），使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。实验方法原理：由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片断包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片断。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。实验步骤：1.目标的DNA模板蓝色的第一对引物结合。第一对引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片断（图中未显示可能的多种产物）。2.使用图中红色标记的第二套引物对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。第一轮1.大小：1192bp2.初始孵育：94℃4分钟3.变性：94℃45秒4.退火：58摄氏度45秒5.聚合：72摄氏度45秒6.PCR循环：36第二轮1.大小：271bp2.初始温育：95℃2分钟3.变性：95℃45秒4.退火：60℃下45秒5.聚合：72摄氏度30秒6.PCR循环：36注意事项：1.引物设计原则：每个特异性引物为24~26个碱基，Tm：64-65%，GC：44-55%。这样你可以同时做多个不同的TAILPCR。2.在第一轮PCR结束之后，将PCR产物稀释1000倍（视情况而定）作为第二轮PCR的模板，第二轮PCR的产物同样稀释1000倍（视情况而定）作为第三轮PCR的模板，这样依次类推。实际操作中可以搞3轮甚至更多，当然做3轮是比较合适了，这个时候PCR的产物已经是高度特异性了。参照反应体系：