抗体酶的催化原理技术方法研究进展及应用的研究

《蛋白质与酶工程》课程论文抗体酶的催化原理、技术方法、研究进展及应用的研究姓名：闫雨专业：生物科学学号：20104083040日期：2013年5月摘要：催化抗体也叫抗体酶，是具有催化活性的免疫球蛋白.由于它兼具抗体的高度选择性和酶的高效催化性，因而催化抗体制备技术的开发预示着可以人为生产适应各种用途的，特别是自然界不存在的高效催化剂，对生物学、化学和医学等多种学科有重要的理论意义和实用价值.综述了催化抗体研究的最新进展，讨论了该领域目前存在的问题，提出了解决这些问题的可能办法。关键词：抗体酶；催化原理;技术方法;研究进展;应用绪论——抗体酶抗体酶(abzyme)，又称催化抗体(cat·alyticantibody)，是指通过一系列化学与生物技术方法制备出的具有催化活性的抗体，它除了具有相应免疫学性质，还类似于酶，能催化某种活性反应。抗体与酶相似，它们都是蛋白质分子．酶与底物的结合及抗体与抗原的结合都是高度专一性的，但这两种结合的基本区别在于酶与高能态的过渡态分子相结合，而抗体则与抗原(基态分子)相结合。抗体与天然酶相比，最大的优点在于抗体的种类是巨大的，免疫系统可以拥有10种抗原特异性不同的抗体分子。制备成功的抗体酶不但能催化一些天然酶能催化的反应，而且还能催化一些天然酶不能催化的反应。1抗体酶1.1抗体酶的发现早在l948年，美国斯坦福大学荣誉退休化学教授[l]_波林(LinusPaulin'f)就提出过渡态理论(transitionstatetheory)[2]。这一理论认为，酶之所以具有催化能力，是因为它与反应分子(底物)的牢固结合的方式，有利于反应中的过渡态(transitionstate)的结构。而这种结构会迅速重新排列成该反应的产物。任何有利于过渡态，而不是其它可能的结构的因素，都能加快化学反应速度。1969年，布兰戴斯大学生物化学家w·詹克斯(w·Jenks)进一步发展了这一理论。他和几位美国科学家认为，如果波林的观点是正确的话，那么利用某一反应过渡态的模拟物作为免疫原，则会得到催化该反应的抗体。这种抗体能特异地识别化学反应的过渡态，并利用其结合能降低反应的活化能。那么，适当的抗体也就能够以一种方式与真正的酶反应物结合．成为“酶家族”中新成员，去催化正常情况下由酶来完成的化学反应。1986年以后，抗体酶研究进入一个新的阶段。这一年的12月，R．A．Lerner和P．GSChutz两个小组同时在《科学》(Science)杂志上报道，他们已成功地得到了具有酶活性的抗体酶。SChutz等人认为对硝基苯酚磷酸胆碱酯（PNPPC）作为相应羧酸二酯水解反应的过渡态类似物，推测用这个类似物作为半抗原诱导产生的单克隆抗体可能对羧酸二酯的水解反应有催化活性。通过对单克隆抗体的筛选，找到了一株MOPC167单抗，后来又找到一株抗体酶T15,经证明该催化反应的动力学行为满足米氏方程。[3]Lerner等人，从金属肽酶的研究成果中得到启发，合成了一个含有吡啶甲酸的膦酸酯类似物为半抗原诱导产生一个单抗6D4，用来催化不含吡啶甲酸的相应羧酸酯化合物的水解反应，使反应加速近1000倍，并表现出底物专一性和对介质pH的依赖性等。[4]1.2抗体酶的基本结构及性质抗体酶主要来自IgG抗体分子[5]。对抗体结构分析表明．IgG分子s是由两条相同的重链及两条相同的轻链靠二硫键连接而成。木瓜蛋白酶作用抗体后，产生三个片断，其中相同的二个片断为抗原结合片断(Fab)；在抗原结合片断中与抗原结合的部位，是“高度可变区”(Fv)，该部位广泛的结构及顺序变化决定了抗体对外来物质的识别特性，其中电荷互补及立体互补是其分子识别的主要特征。2抗体酶催化原理抗体酶能催化酯水解反应，Oxy—Cope重排反应，还原反应，环氧化及氧化物开环反应，Diels—Alder反应，Claisen重排反应。[6]而在抗体催化的反应中，研究最广泛的是酯水解反应，所以在这里只介绍一下酯水解反应的原理。酯水解反应的过渡态是带负电荷的四面体结构。以MOPCI67催化碳酸脂水解为例说明。首先通过化学合成过渡态磷酸脂的类似物——硝基苯磷酰胆碱脂，利用过渡态类似物作为半抗原，并将其与牛血清蛋白偶合，制成抗原注入动物体内，动物体的血液中就会产生可以和过渡态碳酸脂特异性结合的抗体MOPCl67，然后采用单克隆技术分离纯化出MOPCI67。在抗体催化碳酸脂反应中，MOPCI67和过渡态碳酸脂结合后，提高了反应物过渡态的稳定性，降低了反应的活化能，从而加速了水解反应的进程。该反应的产物生成速度常数l(c达到了(o．40±0．04)/min，米氏常数Km为208±431mol／L。)3抗体酶技术方法抗体酶与其催化的活性化合物之间具有结构互补的性质，即酶分子与“反应过渡态”化合物互补，从分子识别角度来看，这种互补关系类似于抗体抗原间的互补作用。抗体酶最初的产生手段是按以下步骤进行的：首先合成稳定的反应过渡态类似物，将此化合物做为半抗原与载体蛋白相连，免疫动物制备单克隆抗体，由它诱导产生的抗体，可以按预定方向取得催化活性。该方法中最重要的是半抗原的分子设计和合成。近年来，抗体酶的产生途径又有新的进展。主要有以下途径和方法：3.1直接引入天然或合成的催化基团[7]①化学诱变法一将合成的或天然的具有催化活性的基团通过化学修饰法引入分子中；②蛋白质工程技术一通过蛋白质工程技术使抗体结合部位的氨基酸残基产生定向改变，既可以直接产生酶活性。也可以对初步具有酶活性的抗体进行进一步改造，构建高活性体。3.2基因工程技术由免疫学可知．对独特的分子抗原，动物可有5～10000个不同的B细胞产生抗体，而通过细胞融合产生的单克隆抗体一般只有上百个。因此重组抗体分子在细菌E．coli中的表达，可以提供抗体库。基因工程抗体库得到的抗体数量比免疫技术得到的抗体要高几个数量级。但该方法中筛选抗体的技术还需进一步完善。3.3相似分子诱导法在反应过渡态类似物难以合成的条件下，采用化学结构相似的舒子如酶的抑制剂分子做半抗原，也可筛选到抗体酶因为免疫系统对一个半抗原可以产生一些结构大致相同．但却存在细微差别的抗体，因此用含有与半抗原类似结{旬的化台物筛选单克隆抗体．也会找到所需要的有特殊识别功能及催化作用的抗体酶。3.4共价抗原免疫法这是在亲和标记抑制剂基础上发展起来的新的抗体酶制备方法。如果以亲和标记剂为半抗原，则抗体结合部位将产生与亲和基团电荷性质相反的基团，如亲核性、亲电性氨基酸，酸性氨基酸、碱性氯基酸等。该途径适用于产生一些晤性部位中含有上述氨基酸的酶。3.5细胞融合法[8]其过程如下：要得到一特定抗原的抗体，如果抗原是小分子，必须将其和载体蛋白相联。然后对此抗原进行免疫，使宿主有机体针对抗原产生抗体，产生抗体的脾细胞与骨髓细胞相融合。融合得到的杂交细胞既能产生抗体又能在体外培养。通过选择培养，杂交细胞得以存留。将杂交体克隆化，即繁殖成母体的同一细胞或分离成菌落。这些菌落能产生单一均匀的抗体。对这些菌落用酶联免疫吸收试验加以筛选，以评价其选择性结合抗原的能力。然后把抗原结合到一种固体支撑物上，再加入含有抗体的介质，这样抗原一抗体复合物随即形成，经过提纯就得到AB—AG复合物。4抗体酶的研究进展4.1抗体酶在有机合成中的应用迄今为止,科学家们已成功开发出能催化所有6种类型的酶促反应和几十种类型的化学反应的抗体酶。抗体原先催化的反应范围也由于重新设计半抗原而扩大,催化效率也因此而得到改善。4.2抗体酶在医疗方面的应用（1）抗体酶在帮助戒毒方面的应用吸毒是一个困绕着很多国家的难题,尤其是吸毒上瘾后很难戒掉,直接拮抗可卡因上瘾的抗体至今还没有找到。一个替换的方法是阻断可卡因、鸦片和受体的结合。虽说抗鸦片的抗体能有效拮抗注射海洛因上瘾的猴子,然而由于抗体和抗原形成复合物后不能再生,必须使用高剂量的抗体使这一应用受到限制。抗体酶则不一样,不但能和抗原结合,而且能使抗原水解而再生,这不但能减少抗体酶的用量,也能减少抗体酶的免疫原性。因此比其它抗体临床应用前景更好。Landry等用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单酯为半抗原,产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解,其催化活性和血液中催化可卡因的丁酰胆碱酯酶差不多,水解后的可卡因片断失去了可卡因刺激功能。因此,用人工抗体酶的被动免疫也许能阻断可卡因上瘾,达到戒毒目的。——图注：过滤太类似物（2）抗体酶用于肿瘤治疗肿瘤病人化疗遇到的最大问题是药物选择性差而导致高毒性及药物半衰期短和对肿瘤浸润性差,因此达到肿瘤细胞表面的药物浓度很低。目前正在发展一种称为抗体介导前药治疗(ADEPT)技术,即将能水解前药释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联,这样酶就会通过和肿瘤结合的抗体而存在于细胞的表面。静脉给药后,当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附近,抗体酶就会将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物,从而提高肿瘤细胞局部药物浓度,增强对肿瘤的杀伤力,达到提高肿瘤化疗效果的目的。当然前药只能被抗体酶水解而不能被内源性酶水解,抗原还要尽量减少免疫原性。5抗体酶的应用前景5.1抗体酶的应用(一)在有机合成领域的应用目前，已成功筛选出可催化6种类型酶促反应和几十种化学反应的抗体酶，可催化许多困难和能量不利的反应．催化类型包括底物异构化反应、酯水解、酰胺水解、酰基转移、Claisen重排反应、光诱导反应、氧化还原、金属螯合、环化反应等，抗体酶还可以作为手性助剂控制光加成反应产物的立体化学，用于手性化合物的拆分，还可用于探索化学反应机制．(二)在医学领域的应用利用抗体酶催化药物在体内的还原，有利于机体对药物的吸收，并降低药品的毒副作用；将抗体酶技术和蛋白质融合技术结合在一起，设计出既有催化功能又有组织特异性的嵌合抗体，用于切割恶性肿瘤；将抗体酶直接作为药物，以治疗酶缺陷症患者¨(三)在戒毒领域的应用抗体酶可以拮抗可卡因等麻醉剂的成瘾性，使可卡因失去刺激功能，以帮助瘾君子戒除毒瘾．抗体酶还可以水解清除血液中的毒素，如分解可卡因、有机磷毒剂等．(四)在前药设计中的应用[9]前药(prodrug)是指为降低药物毒性而设计的一类自身无活性或活性较低，需在体内经代谢转化为活性药物以发挥作用的化合物．抗体酶在正在发展的ADEPT体系中成功地对前药进行活化，提高了肿瘤治疗的选择性，显示出很好的应用前景[10]．ADEPT体系，即抗体靶向的酶前药治疗(antibodydirectedenzymeprodrugtherapyADEPT)体系．将能催化前药转化为肿瘤细胞毒剂的酶，与肿瘤细胞专性抗体相偶联，酶通过与肿瘤抗体的结合而存在于肿瘤细胞表面，当前药扩散至肿瘤细胞表面或附近时，抗体酶就会将前药迅速水解，释放出抗肿瘤药物．这样大大提高了肿瘤细胞附近局部药物的浓度，增强对肿瘤细胞的杀伤力，减少对正常细胞的杀伤作用[11]经过科学家们的不断努力，抗体酶在ADEPT体系中的应用将日益完善，有可能成为癌症化疗的重要武器。5.2.前景抗体酶的研究是当今科学前沿多学科研究的交汇点，吸引着合成化学家、生物学家、免疫学家、化学动力学家、催化学家的格外关注。它突破了传统的束缚、大分子、配位化合物等模拟酶的框框，开辟了崭新的模拟酶研究的方向，开辟了催化剂研究的新领域，无论是在理论探索方面或是实践应用方面，都具有极其广阔的前景。它将在医学、化学、生物学、免疫学、制药学等诸多学科中发挥重要的作用。(1)可以使不可能发生的化学反应变为可能。(2)可以使苛刻条件下的化学反应在温和条件下实现。(3)可以选择性地催化平行反应中的某一反应，从而大大增加产品的产率。它可以实现有机化学家梦寐以求的不对称合成，只催化生成某一光学异构体的反应，使原料的利用率大大提高。(4)在不久的将来，有可能研究成功蛋白质氨基酸序列快速分析的抗体酶，从而大大简化和加速蛋白质氨基酸序列的测定。(5)病毒蛋白在水解过程中的过渡态相似物诱发的抗体酶，可作为医学上的接种疫苗。(6)指导未知酶的寻找。有些反应，如Cope重排和Dids-Alter反应，明明知道是酶催化的，但时至今日，人们对催化上述反应的酶仍一无所