接种率对酵母发酵性能和啤酒风味的影响

1接种率对酵母发酵性能和啤酒风味的影响摘要：啤酒发酵过程的体积生产率可通过提高使用较高的接种率（即较高的接种量）的菌株。然而，在接种率对发酵和啤酒质量参数的影响却从未被系统评估。在这项研究中，五种不同接种量的菌株应用于实验室规模的发酵中，研究其对酵母的生理和啤酒质量的影响。发酵率明显增加，净酵母生长随接种速率的降低，而降低对酵母活力的影响。当投放较高的酵母浓度时，不饱和脂肪酸在发酵的初始阶段的积累被抑制。当该该基因的表达水平Hsp104和HSP12和海藻糖浓度较高时接种率增加，表明适度的暴露在高浓度下的细胞应力。接种速率对香气化合物生产的影响是相当有限的，总双乙酰含量异常，接种率大大增加。这些结果表明，酵母的生理平衡和风味最不显著或产生负面影响时，接种速率的变化。然而，还需要进一步研究，以全面优化酿造啤酒以符合高密度的人口条件关键词：发酵酿造酵母酵母新陈代谢酵母生理学应激反应风味介绍：在传统生产的啤酒中，发酵过程是最耗费时间的一步,这大约需要1-2周之前进入成熟期。因此,现代发酵科学和技术的一个重要目标是减少发酵时间且产生一个最终产品类似的质量,从而使大节省时间和金2钱。提高容积效率的啤酒发酵过程,可以采用几种策略。例如，一个主要的方法是连续发酵与固定化酵母的应用，允许大量增加细胞密度，这形成了更快的发酵速率。在使用固定化酵母初级啤酒发酵的兴趣似乎是持续的工程问题，不平衡啤酒的风味和unreal-ISED成本优势（Bránick等，2005），已经下降。然而，该技术的主要目的是通过在反应器中最大化细胞浓度来提高生产率。因此，另一种有前途的策略可能是提高在分批发酵罐中悬浮的酵母细胞的数量（即“接种率';冈部等人1992;Vereen等人2008）。但是，增加的接种率也可能对酵母群或啤酒的风味轮廓的生理状况造成有害的副作用。在关键的酵母，发酵和啤酒质量参数对接种率的影响从来没有被系统地评估。在发酵过程中酵母的生理机能和活动在接种和仪器实现一致的发酵,导致啤酒可接受的质量。在啤酒发酵的麦芽汁,一些生理变化发生在酵母人口。一开始发酵,增加不饱和脂肪酸和植物固醇是至关重要的正常增长模式的酵母发酵的人口在接下来的阶段,因此也为适当的整体发酵过程(大卫和Karson1973)。这些基本的形成脂质所需的能量来源于糖原的分解,最重要的储碳水化合物的酵母。因此,糖原含量酵母发酵效能的关键因素(奎恩和Tub1982)。氧气从麦芽汁的消失后,糖原acumen-尖吻鲈属酵母在指数增长阶段。最大的糖原水平达到主发酵结束时(博尔顿2000)。那一刻,生长和细胞分裂被逮捕,由于稀释的基本细胞脂质在母亲和女儿(白羊座和Karson1977)。酵母细胞停止生长时,他们进入一个静止固定相。糖原为细胞提供能量的维护功能在固定相在存储阶段之间种植和下一个投手(博尔顿2000)。调节糖原内容复杂,发生部分酵母环腺苷酸(营)蛋白激酶(PKA)途径(史密斯etal.1998年)。高PKA活性压制糖原累积,但当一个重要营养与生长培养基逐渐消耗,PKA活性降低和糖原含量增加(弗朗索瓦和Parous2001)。酿酒酵母在发酵过程中遇到各种各样的压力和酵母处理(吉布森etal.2007年)。暴露在适度的压力下可能会导致遗传被修改,产生代谢和酿酒酵母的生理反应。反过来,这些细胞功能的变化可能会导致随后的发酵性能改变。当压力是严重或损伤积累到令人无法忍受的水平,生存能力开始下降(2003年詹金斯和肯尼迪)。酵母细胞可以通过几种应激反应机制适应不良环境(Sedaris和马杰2003)。两个主要的应激反应通路在酿酒酵母中一般是应激反应和热休克反应。后者是激活特别热应力。一般应激反应可以由不同的外部压力代理,如接3触热、接触乙醇,渗透性增加,活性氧或饥饿的必需营养素。一般的应激反应是介导的转录激活物Msn2pMsn4p,在压力接触成为主管激活转录应力响应要素(压力)驱动基因(Martinez-Pastoretal.1996;史密斯etal.1998年)。强调序列已确定在许多压力诱导基因的启动子部分,如热休克蛋白(HSP)的基因(例如HSP12和HSP104)和基因,有助于合成(TPS1、TPS2TPS3和TSL1)和退化(NTH1NTH2)海藻糖(Winderickxetal.1996;Zahringeretal.1997年)。此外,STRE-containing基因包含其他边条——保守党参与压力诱导转录序列,如热休克元素(HSE)或抗氧化剂的反应元素(;Estrus2000)。压力诱导的表现,授予,由camp-PKA消极监管途径(Thevelein和deWined1999;Verstrepenetal.2004年)。因为二糖海藻糖的积累是诱导在应对各种各样的压力条件下,热休克、高渗透性、乙醇和接触有毒化学物质,海藻糖ace-表述中可以用作通用指标压力酵母细胞(Makaraetal.1996;Hounsaetal.1998年)。发酵初、高葡萄糖水平可完全激活营地/PKA通路,从而导致平移后激活诱导的中性海藻糖酶和其NTH1基因,以及镇压的海藻糖合酶基因,导致减少了海藻糖的水平(Zahringeretal.2000年)。当消耗葡萄糖,麦芽糖开始被同化和PKA活动减少,导致形成的海藻糖(Verstrepenetal.2004年)。在压力条件下,海藻糖保护细胞的高水平由绑定mem-膜和蛋白质(弗朗索瓦和Parous2001)。然而,在复苏压力,海藻糖必须由海藻糖酶迅速水解,释放细胞结构的海藻糖(Zahringeretal.2000年)。快速降解resume海藻糖可能是必要的,正常的细胞活动(吉布森etal.2007年)。啤酒最重要的感官特征是由酵母在发酵过程中形成的风味化合物的醇越高,“水果”的酯类(导致酒精和水果口味)和附近的二酮和硫化合物(会导致off-flavors)是最重要的。因为这些风味化合物的起来——list密切相关酵母的生长和生理状态,影响酵母代谢和生理因素可以很容易地改变啤酒的味道。改变工艺参数,如麦芽汁成分、温度、搅拌和接种速率可以导致啤酒风味平衡显著变化(冈etal.1992;博斯韦尔etal.2002;杜福尔etal.2003;Saerensetal.2008年)。在此前的一项研究中,高密度的细胞与不同的啤酒酵母进行菌株发酵(Vereenetal.2008年)。得出结论,在接种率高时,发酵率增加两到四倍---荷兰国际集团(in)取决于酵母菌株。观察到异常在4不同的发酵细胞中呈现。细胞密度对产生的风味剖面和特定的酵母喜好——end有重要影响。在这项研究中,一个工业酵母菌株从先前的研究中被选择(Vereenetal.2008年)用来调查系统更高的接种体大小对酵母发酵性能的影响。我们发现,接种率没有负面影响酵母的生理条件。只有风味剖面的影响在某种程度上,尤其是双乙酰-traction农用地。这些知识将会对进一步的优化至关重要——station高细胞密度啤酒发酵的有前途的技术。材料和方法酵母菌株实验进行了酿酒酵母（巴斯德）（CMBSPV09）（中心麦芽和啤酒酿造科学，鲁汶大学，文利，比利时）的工业啤酒酿造菌株，从啤酒酵母储存容器中获得。无菌全麦芽麦汁的跳频为15°柏拉图（°P）的提取物含量（°渗透：克提取/100g的麦芽汁;68％麦芽糖，19％麦芽三糖，9％葡萄糖，4％果糖），游离的氨基氮含量（404ppmFAN）在啤酒厂及整个研究中使用。发酵条件和采样酵母浆料的浓度和活力通过流式细胞术（Eastcote，BioDETECTAS，奥斯陆，挪威）之前所需要的量被投在麦芽汁进行了测定。五个不同的接种速率施加：（1）10×106活细胞/ml，（2）20×106活细胞/ml，（3）40×106活细胞/ml，（4）80×106活细胞/ml的和（5）120×106活细胞/ml。所有的发酵均一式两份进行，在高大管（高75厘米，8厘米内径），含1.8升无菌的15°渗透麦汁介质。麦芽汁被无菌空气充气填充，接着充分混合反相管20倍的顶部空间。所述发酵均在15℃下进行，并通过狭窄的取样管抽出样品（从底部15厘米），在N2超压的辅助下经常进行监测。样品直接在冰上冷却，并使酵母发酵麦芽汁通过离心（2800转，3分钟，2℃）分离。发酵停在80％左右的发酵器（ADF）观察，将试管于2℃进行24小时冷却以沉淀酵母。收集上清液，剩下的浆料再悬浮于1升冷的无菌水，之后，样品被送去进行酵母裁剪。发酵分析离心前，数量和悬浮的酵母细胞的活力通过流式细胞术（Eastcote，5BioDETECTAS，奥斯陆，挪威）进行计数。死细胞直接用PBS中的10％体积/体积碘化丙啶（70355，Sigma公司）进行染色。在发酵中的比重的衡量用一个手持式密度计（DMA35N，安东帕，奥地利格拉茨）测量，但最终提取物和酒精含量的测定用DMA4500密度分析仪和Alcolyser（安东帕，格拉茨，奥地利）。游离氨基氮由基础的方法测量，根据欧洲啤酒公约（1998EBC）所定义的标准方法测定。最终啤酒的甘油含量与甘油试剂盒（K-GCROL，Magazine的国际，爱尔兰）根据制造商的说明被确定。苦味化合物用异辛烷从酸化啤酒中提取并且合并在石英比色皿275纳米下测定吸光度（1998EBC）。前味化合物的分析挥发性化合物的浓度通过顶空气相色谱法测定。未稀释的上清液五毫升经冷却，过滤，转移至小瓶中。将小瓶进行60分钟加热处理，在60℃时至所有α乙酰乳酸转化为双乙酰。顶空自动进样器取样至小瓶中，用AutoSystemXL气相色谱仪进行了校准分析（HS40;PerkinElmer公司制，韦尔兹利，MA，美国），并配有一个Chrompack-蜡52炭黑柱（长度为50m，内径为0.32毫米;层厚度1.2微米;瓦里安，帕洛阿尔托，加利福尼亚州，美国）。注射（针温度70℃）之前，将样品加热16分钟，在60℃下，在顶部空间自动取样器。氦气作为载气。烘箱温度保持在50℃状态7.5分钟，然后以25℃/分钟的速度升至110℃，，并保持在该温度下3.5分钟。检测二甲基硫醚（DMS），酯和高级醇用火焰离子化检测器（FID）检测;总乙酰（丁二酮+α-乙酰乳酸）用电子捕获检测器（ECD）检测。FID和ECD的温度分别保持恒定在250℃，200℃下。进行了一式两份的结果分析与珀金埃尔默Turbochrom导航软件分析，并且被重新计算为5％（体积/体积）乙醇。酵母生理学糖原和海藻糖糖原和海藻糖的定量是基于内韦斯等人的方法。（1991）。酵母样品用冷蒸馏水洗涤三次。然后，将酵母悬浮液经过膜滤器过滤（孔径0.45微米）和细胞沉淀的25-50毫克（湿重）称重并立即存储于-80℃。融化后，将沉淀再悬浮于1ml的0.25M的Na2CO3和在95℃下孵育206分钟。其后，将萃取物冷却并离心分离，将10μl的上清液（在13,000rpm下1分钟）撤回并调节至pH5.5，5微升的1N乙酸海藻糖测定。该提取物的其余部分再悬浮，并再温育在95℃进行40分钟。冷却后，将10μl悬浮液与5微升的1N乙酸调整并用于糖原determina-混合。海藻糖（0，1，2，4和8毫米的0.25M的Na2CO3）和糖原标准（0，1，2和3毫克/毫升的0.25M的Na2CO3）中与酵母相同的方式处理，用于提取。海藻糖酶分解与25微升的缓冲海藻糖混合，含5微升缓冲液（300毫米醋酸钠，30mM的氯化钙，pH值5.5）和20μL腐质海藻糖酶制剂（约350U/ml的;好心的分子细胞实验室提供生物学，鲁汶大学，文利，比利时）。糖原被分解为25微升anα，淀粉葡萄糖苷酶的缓冲组合，含1.2毫克α-淀粉葡萄糖苷酶（500U，罗氏诊断，印第安纳波利斯，美国）每100毫升缓冲液（80毫米醋酸钠，pH值4.7）。所有糖原和海藻糖的样品和标准品，然后再悬浮，并在37℃下保持2小时。离心后，将10μl上清液放入96微量滴定板的孔中，并加入200μlGOD-PAP试剂（Dialab，维也纳新村，奥地利）中的溶液。测定吸光度在505