干细胞在骨衰老

项目名称：干细胞在骨衰老与再生中的作用及关键信号分子调控首席科学家：金岩中国人民解放军第四军医大学起止年限：2011.1至2015.8依托部门：总后勤部卫生部二、预期目标本项目的总体目标：围绕骨衰老与再生研究的重大科学问题，阐明干细胞在骨发育与再生中的作用及相关的调控机制，明确骨增龄、衰老过程中相关干细胞的变化特征及其调控机制，明确干细胞在成骨-破骨平衡中的作用，阐明干细胞功能异常导致骨质疏松发病的分子机制，建立相应的治疗骨质疏松和促进骨再生的新策略。通过本项目的研究，搭建骨衰老和再生研究平台，培养和建立一支学术水平高、创新能力强的研究人才队伍，使我国在相关领域的研究达到国际先进水平。五年预期目标:1.阐明骨发育、衰老和再生修复中相关干细胞分化的关键基因和信号通路调控，明确干细胞在骨再生修复中动员、定向分化和归巢中的作用及其分子机制，2.明确骨增龄和衰老过程中相关干细胞的生物学行为变化规律以及干细胞在成骨-破骨平衡中的作用及调控机制，阐明增龄及衰老中关键信号通路及微环境对干细胞成骨分化的调控。3.明确基因敲除、去势骨疏动物模型和骨质疏松患者相关干细胞生物学行为变化特点及调控机理，阐明不同性激素水平对干细胞成骨功能的影响，确定干细胞在骨质疏松发病中的关键作用。4.对比不同来源干细胞治疗骨质疏松的效果；建立应用小分子化合物预防和治疗骨质疏松的方案；应用干细胞与组织工程技术治疗骨质疏松状态下的骨缺损。5.发表具有较高影响因子的代表性SCI论文20-40篇；申请发明专利5～10项；培养博士后10～20人，博士40～60人，硕士20～40人；争取1～2人获得全国百篇优秀博士论文；吸引国外优秀的学者和留学博士回国工作。三、研究方案总体研究思路：骨在发育、增龄、衰老和受损后的再生过程中始终保持着组织动态变化的特点，以往研究多侧重于终末分化细胞的功能研究，缺乏系统的网络调控研究，且主要对成骨细胞、破骨细胞这两种效应细胞展开研究，而对其上游的干细胞关注甚少。项目组前期工作显示干细胞在上述过程中扮演了至关重要的角色，同时干细胞功能受到严密的分子调控，当关键分子调控途径产生异常时，常引起干细胞功能受损从而导致骨组织发育不良、早衰或由衰老引起的骨质疏松、骨损伤愈合与再生修复能力下降等表型。因此，干细胞是探讨骨组织相关重大疾病防治策略的重要靶标，阐明干细胞在骨发育和衰老过程中的重要角色，及其在骨组织再生修复中发挥的作用和机制，不仅能为深入认识人体器官发育提供理论依据，而且将提供新的组织退行性病变的防治策略。本项目拟应用模式动物，以骨发育、衰老和再生不同阶段的相关干细胞研究为切入点，探讨干细胞在上述过程中关键信号通路变化规律及机制；阐述干细胞生物学功能改变在骨质疏松发病中的重要作用；在此基础上建立骨质疏松预警方案及基于调节干细胞功能的治疗策略；确定工程化策略在骨折和骨缺损环境中的再生治疗模式。技术路径：可行性分析：1.理论和方法可行：干细胞在骨的发育、衰老和再生过程中扮演着至关重要的角色，而在此过程中干细胞受到复杂的各种信号分子的网络调控，是决定其介导的骨生理病理表型的关键因素。本项目组基于基因敲除小鼠的前期研究揭示了老龄性骨质疏松与骨髓间充质干细胞功能不良相关，证明一些关键基因在骨髓间充质干细胞的成骨向分化中起重要作用，其缺失可导致骨质疏松疾病发生。在骨修复再生方面，本组以不同来源的间充质干细胞作为种子细胞，运用组织工程技术成功修复多种类型的大动物骨组织缺损，证明了利用干细胞进行骨质疏松性骨损伤的再生修复的可行性。而现代生物技术尤其是细胞、分子生物学的发展为我们阐明此调控网络提供了成熟有效的方法体系，本组具有的条件性基因敲除/入、RNAi、高通量小分子化合物筛选平台等都为本项目的实施打下基础。2.拥有多种模式动物作研究模型：本项目组成员长期从事骨发育再生的研究，已建立一批转基因动物模型，如Cre-ERT;PtenCO/CO小鼠表现出骨发育不良，Zmpste24-/-小鼠出现早衰表型，MT1-MMPPRX-CO/PRX-CO小鼠出现骨密度降低和代谢异常，为在分子、细胞、组织和个体水平研究关键基因和信号通路在相关成骨干细胞中的作用提供有力工具。此外，本项目组还拥有多种稳定的发育和再生修复实验动物模型:如BMP信号通路(Bmpr1a激活或敲除模型)Bmpr1aCO/CO条件打靶小鼠,低氧诱导因子信号通路Hif1aCO/CO和VhlhCO/CO条件打靶小鼠，Pten/PI3K信号通路PtenCO/CO条件打靶小鼠，以及Cre-ERT,OC-Cre,Col2-Cre-ERT,Col2-Cre等工具小鼠。此外，Calponin完全敲除小鼠已拿到嵌合体。另外，还可利用成熟方法制备的去势动物以及自然增龄衰老的动物模型开展相关研究。3.有前期研究工作基础：在干细胞分化调控机制的研究方面，本组发现通过上调Klotho和胰岛素样受体I使受体鼠的寿命延长和增龄性变化特征的减弱，从机制上阐释了BMSC诱导形成骨髓的功能，并为增龄性疾病的治疗提供了新的思路和策略(Blood,2009)。证明利用过表达端粒酶基因可增强BMSC体外和体内的骨组织形成能力(NatBiotechnol,2002)。在细胞功能调控机制研究方面，本项目组发现体外敲除beta-catenin基因抑制成骨细胞的增殖，改变其分化并且减少其在BMP-2处理下的成骨应答，表明BMP-2可能在一定程度上通过调节beta-catenin信号调节成骨细胞的功能（JCellBiochem,2009）。发现经典Wnt通路抑制剂DKK2能促进成骨细胞终末分化并矿化，抑制DKK2后成骨细胞矿化受阻，表明DKK2在成骨细胞分化后期起重要调节作用（NatGenet,2005）。此外，使用Axin2-lacZknockout(KO)小鼠探索Wnt-beta-catenin信号在骨形成中的作用，证明在成年小鼠骨形成过程中Axin2是一种关键的负调节因子，通过β-catenin–BMP2/4–Osx信号通路调节成骨分化（JCellSci,2009）。本项目组发现Smurf2促进细胞成骨分化和软骨成骨过程，并证明此作用与beta-catenin水平上调有关（JBoneMinerRes,2008）。证明FGFR3获得性的突变导致骨量的下降，这与p38的磷酸化水平上调从而导致Erk1/2活性提高有关，而且是通过调控成骨细胞和破骨细胞的活性来实现的（HumMolGenet,2010）。证明miR-204/211在MSC成脂分化中表达上升，是Runx2的内源性负调节因子，在间充质干细胞中能够抑制成骨分化并促进成脂分化（StemCells,2010）。本项目组证明了炎症、增龄、细胞外基质等微环境的变化可以影响干细胞的生物学行为，其中Wnt通路可能发挥着关键的调控作用（Biomaterials,2009,2010,TissueEngineering2004，2006，2007，2008，2009，BiologyoftheCell,2006，2007A，2007B，StemCellDevelopment,2008，2009，CellBiol.Int,2006，2008，JPeriodontalRes,2008A，2008B）。在骨质疏松研究方面，本项目组建立了基因敲除小鼠骨骼表型标准化分析平台：利用软X线、骨密度、μCT初步筛查基因敲除小鼠的骨代谢异常；利用组织学、形态计量学及荧光标记分析基因敲除小鼠骨骼的静态参数和动态的骨形成变化。发现Bgn-/-小鼠出现增龄性骨质减少，进一步发现Bgn-/-缺失小鼠中BMSC克隆形成能力下降，凋亡活动增强，合成I型胶原能力降低（Bone,2006）。发现Casp3-/-和Casp3+/-小鼠具有骨化延迟和骨密度降低的表型，而且这一过程是由BMSC骨向分化功能受损造成的，证明caspase-3通过影响TGF-beta/Smad2通路和细胞周期调节蛋白控制BMSC成骨分化，其表达异常会造成骨质疏松症状（JClinInvest,2004）。本项目组发现T细胞介导的BMSC功能损伤在小鼠卵巢切除后骨质疏松发病机制中起重要作用，进而证明基于阿司匹林的BMSC干预可逆转这一过程实现新骨形成（PLoSONE，2008）。在骨损伤再生修复研究方面，本项目组围绕骨、关节、软组织复合损伤的修复与再生开展了大量的研究工作，解决了多项骨组织工程技术从基础研究向临床应用过渡的关键性技术问题，建立了人BMSCs定向诱导成骨的体外培养与大规模扩增体系。在组织工程骨种子细胞领域，建立了骨髓间充质干细胞、脂肪源性干细胞、表皮干细胞、脐血间充质干细胞等多种成体干细胞的分离、培养、扩增、诱导、鉴定等相关技术平台（CellsTissuesOrgans,2008;Cryobiolgoy,2008a,b;Biomaterials,2008,2009;TissueEngPartA,2010）。利用骨特异性I型胶原启动子（2.3Col）与GFP结合示踪外源性骨髓间充质干细胞在体内的转归，发现干细胞直接参与骨形成与再生（MolTher.2009）。在支架材料方面，开发了多种具有自主知识产权的可降解骨组织工程生物材料，例如β－磷酸三钙（β-TCP）、同种异体脱钙骨、钙镁陶瓷等（Biomaterials,2008）。并以BMSCs、ASCs及脐血间充质干细胞作为种子细胞，运用组织工程技术成功修复多种类型的大动物骨组织缺损（Biomaterials,2007;JMaterSciMaterMed,2008;Biomaterials,2009;TissueEngPartA,2010）。项目组还进一步开展了骨组织工程的初步临床应用研究，并取得了满意的修复效果。在小分子化合物筛选研究方面，本组前期的筛选工作着重于从含有五万多种标志性小分子化合物文库中筛选抑制细胞衰老的小分子化合物。筛选出的部分小分子化合物在动物实验上可以延缓衰老及骨质疏松，表明高通量方法筛选抗骨质疏松有效小分子化合物具有可行性。我们将利用此平台，以促进干细胞向成骨细胞分化为目的针对性地筛选抗骨质疏松的小分子化合物。上述前期工作为本课题的进一步研究奠定基础和提供完备的技术条件。4.实验条件有保障：本项目组在骨发育和再生生物学方面已建立了相应的技术平台，在细胞培养、组织器官重建、基因工程技术、各种蛋白和分子水平的分析与鉴定、体内外分化模型的建立和应用研究等与干细胞、组织工程和再生医学相关的研究技术方面积累了非常丰富的经验，从而为本项目的完成提供了技术保障。本项目组由第四军医大学组织工程研发中心、全军骨科研究所、第三军医大学野战外科研究所（国家重点实验室）、组织工程国家工程研究中心、香港大学生物化学系等联合组成，拥有完善的实验设施和条件，可提供本项目需要的全部大中型设备。本项目的上述研究成果均基于该研究平台，得到了国内外同行的广泛重视。与美国南加州大学、罗彻斯特大学、英国利兹大学等保持密切的合作。这些为本项目的实施提供了物质保障。5.研究队伍实力雄厚：本项目组各课题负责人及学术骨干均为干细胞基础与应用、骨发育再生、衰老研究领域的知名学者，其中王正国院士是国内再生医学界权威专家、罗卓荆教授是骨科界长江学者、张文杰研究员是骨再生以及干细胞分化调控研究领域专家，项目组学术骨干周中军教授、刘建教授、施松涛教授、陈棣教授、刘鹏教授等是国际衰老研究、干细胞与再生医学、骨发育与再生研究领域的著名学者，在课题研究和人才培养方面将发挥重要的作用。创新点和特色：1.系统阐明相关干细胞在骨发育到衰老变化过程中的关键作用和调控机制，将为其他器官的衰老再生研究提供可借鉴的研究模式。2.深入探讨干细胞在骨质疏松发病中的作用机理及关键信号分子调控规律，为骨衰老、骨质疏松防治提供新策略。3.利用本项目组拥有的骨质疏松、早衰及发育缺陷的多种模式动物，结合临床患者资源开展研究，为将基础研究转化为临床应用提供基础。课题设置：各课题间相互关系本项目围绕骨发育、衰老与再生进行相关研究，首先通过模式动物研究明确骨发育与再生中的重要分子调控机制，为