实验基础知识细胞因子

一、TNF-肿瘤坏死因子（TumorNecrosisFactor，TNF）可分为TNFα和TNFβ两种，前者来自单核巨噬细胞，后者由活化T细胞产生，是具有重要生物活性的细胞因子。存在于细胞上的TNF受体主要有两种：TNFRⅠ和TNFRⅡ，血清中存在的是可溶性的TNFR（sTNFRⅠ,sTNFRⅡ），它们的相互作用不仅对多种肿瘤细胞有细胞毒作用，还与炎症和发热反应、关节炎、败血症及多发性硬化等疾病有密切关系。1.TNF的产生（1）TNF-α是一种单核因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，LPS是较强的刺激剂。IFN-γ、M-CSF、GM-CSF对单核细胞/巨噬细胞产生TNF-α有刺激作用，而PGE则有抑制作用。前单核细胞系U937、前髓细胞系HL-60在PMA刺激下可产生较高水平的TNF-α。T淋巴细胞、T细胞杂交瘤、T淋巴样细胞系以NK细胞等在PMA刺激下也可分泌TNF-α。SAC、PMA、抗IgM可刺激正常B细胞产生TNF-α。此外，中性粒细胞、LAK、星状细胞、内皮细胞、平滑肌细胞亦可产生TNF-α。（2）TNF-β是一种淋巴因子，抗原和丝裂原均可刺激T淋巴细胞分泌TNF-β。PMA刺激RPMI1788B淋巴母细胞可分泌高水平TNF-β。3.TNF的受体（1）TNF-R的分型：TNF-R可分为两型：Ⅰ型TNF-R，55kDa，CD120a，439氨基酸残基，此型受体可能在溶细胞活性上起主要作用；Ⅱ型TNF-R，75kDaCD120b，426氨基酸残基，此型受体可能与信号传递和T细胞增殖有关。两型TNF-R均包括胞膜外区、穿膜区和胞浆区三个部分，胞膜外区有28%的同源，但在有包浆区无同源性，可能与介导不同的信号转导途径有关。TNF-R属于神经生长因子受体（NGFR）超家族。TNF-α和TNF-β的受体可能是同一的。TNF-R存在于多种正常及肿瘤细胞表面，一般每个细胞受体数目有103～104，如ME-180肿瘤细胞系TNF-αR约2000/个细胞，Kd为2*10-10M。不同细胞表面TNF-αR的数目和亲和力似乎与细胞对TNF-α的敏感性并不平行。TNF-α与相应受体结合后信号传递的机理尚不清楚，可能与活化蛋白激酶C（PKC），催化受体蛋白磷酸化有关。（2）可溶性TNFR：TNF结合蛋白（TNF-BP）是TNFR的可溶性形式，有sTNfRⅠ（TNF-BPI）和sTNFRⅡ（TNF-BPⅡ）两种。一般认为sTNFR具有局限TNF活性，或稳定TNF的作用，在细胞因子网络中有重要的调节作用。Seckiner1988年发现发热患者尿中有TNF抑制物，分子量为33kDa。Olsson1989年在慢性肾功不全患者血和尿中也发现有TNF-BP。TNF-BP可与TNF特异结合，抑制TNF活性，如抑制其细胞毒活性和诱导IL-1产生，可促进皮下接种MethA肉毒的生长，可见于正常妊娠尿中。炎症、内毒素血症、脑膜炎双球菌感染、SLE、HIV感染、肾功不全时以及肿瘤时可升高。可溶性TNFR可有效地减轻佐剂性关节炎的病理改变以及败血症休克。4.TNF的生物学活性TNF-α与TNF-β的生物学作用极为相似，这可能与分子结构的相似性和受体的同一性有关。但有某些生物学作用方面也有不同之处。（1）杀伤或抑制肿瘤细胞：TNF在体内、体外均能杀死某些肿瘤细胞（cytolyticaction)，或抑制增殖作用（cytostaticaction）。肿瘤细胞株对TNF-α敏感性有很大的差异，TNF-α对极少数肿瘤细胞甚至有刺激作用。用放线菌素D、丝裂霉素C、放线菌酮等处理肿瘤细胞（如小鼠成纤维细胞株L929）可明显增强TNF-α杀伤肿瘤细胞活性。体内肿瘤对TNF-α的反应也有很大的差异，与其体外细胞株对TNF-α的敏感性并不平行。同一细胞系可能有敏感株和抵抗株如L929-S和L929-R。此外，靶细胞内源性TNF的表达可能会使细胞抵抗外源性TNF的细胞毒作用，因此，通过诱导或抑制内源性TNF的表达可改变细胞对外源性TNF的敏感性。巨噬细胞膜结合型TNF可能参与对靶细胞的杀伤作用。TNF杀伤肿瘤的机理还不十分清楚，与补体或穿孔素（perforin)杀伤细胞相比，TNF杀伤细胞没有穿孔现象，而且杀伤过程相对比较缓慢。TNF杀伤肿瘤组织细胞可能与以下机理有关。①直接杀伤或抑制作用：TNF与相应受体结合后向细胞内移，被靶细胞溶酶体摄取导致溶酶体稳定性降低，各种酶外泄，引起细胞溶解。也有认为TNFN激活磷脂酶A2，释放超氧化物而引起DNA断裂，磷脂酶A2抑制剂可降低TNF的抗病效应。TNF可或改变靶细胞糖代谢，使细胞内pH降低，导致细胞死亡。②通过TNF对机体免疫功能的调节作用，促进T细胞及其它杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤。③TNF作用于血管内皮细胞，损伤内皮细胞或导致血管功能紊乱，使血管损伤和血栓形成，造成肿瘤组织的局部血流阻断而发生出血、缺氧坏死。（2）提高中性粒细胞的吞噬能力，增加过氧化物阴离子产生，增强ADCC功能，刺激细胞脱颗粒和分泌髓过氧化物酶。TNF预先与内皮细胞培养可使其增加MHCⅠ类抗原、ICAM-1的表达，IL-1、GM-CSF和IL-8的分泌，并促进中性粒细胞粘附到内皮细胞上，从而刺激机体局部炎症反应，TNF-α的这种诱导作用要比TNF-β为强。TNF刺激单核细胞和巨噬细胞分泌IL-1，并调节NHCⅡ类抗原的表达。（3）抗感染：如抑制疟原虫生长，抑制病毒复制（如腺病毒Ⅱ型、疱疹病毒Ⅱ型），抑制病毒蛋白合成、病毒颗粒的产生和感染性，并可杀伤病毒感染细胞。TNF抗病毒机理不十分清楚。（4）TNF是一种内源性热原质，引起发热，并诱导肝细胞急性期蛋白的合成。TNF引起发热可能是通过直接刺激下丘脑体温调节中枢和刺激巨噬细胞释放IL-1而引起，还可通过IL-1、TNF-α刺激其它细胞产生IL-6。（5）促进髓样白血病细胞向巨噬细胞分化，如促进髓样白血病细胞ML-1、单核细胞白血病细胞U937、早幼粒白血病细胞HL60的分化，机理不清楚。TGF-β可抑制TNF-α多种生物学活性，但不抑制TNF-α对髓样白血病细胞分化的诱导作用，甚至还有协同效应。（6）促进细胞增殖和分化：TNF促进T细胞NHCⅠ类抗原表达，增强IL-2依赖的胸腺细胞、T细胞增殖能力，促进IL-2、CSF和IFN-γ等淋巴因子产生，增强有丝分裂原或外来抗原刺激B细胞的增殖和Ig分泌。TNF-α对某些肿瘤细胞具有生长因子样作用，并协同EGF、PDGF和胰岛素的促增殖作用，促进EGF受体表达。TNF也可促进c-myc和c-fos等与细胞增殖密切相关原癌基因的表达，引起细胞周期由Go期向G1期转变。最近报道INF-β（LT）是EB病毒转化淋巴母细胞的自分泌生长因子，抗LT抗体、sTNfR以及TNF-α能抑制EB病毒转化淋巴细胞的增殖。IL-1、IFN-γ和GM-CSF对TNF的生物学作用有明显的增强作用，可能与增加细胞TNF受体的表达有关。已报道一种抗TNF-α单克隆抗体，可模拟TNF-α的某些生物学作用，这种现象在其它因子中还尚未见到。IFN-γ973年Younger和Salvin发现来自淋巴细胞培养上清中存在一种IFN，但抗原性不同于发现的IFN，遂命名Ⅱ型IFN，1980年统一命名为γ干扰素。诱导吲哚胺2，3-双加氧酶的合成。1IFN-γ可，后者参与色氨酸分解代谢，使色氨酸转变为犬尿氨酸，使血液中色氨酸的水平下降，可能与出现神经系统症状有关。IFN-γ诱导巨噬细胞可诱导性一氧化氮合酶（iNOS）产生，促进NO的合成，IFN-γ还可诱导小胶质细胞星形细胞的iNOS产生，可能与中枢神经系统的某些疾病的发生或保护作用有关。IFN在完全没有内毒素时不能刺激IL-1转录，反而在转录水平抑制IL-1自身诱导的IL-1产生，但IFN-γ可增加LPS诱导的IL-1转录翻译和分泌。bcl-2B淋巴细胞瘤-2基因简称bcl-2（B-celllymphoma-2）,是细胞凋亡研究中最受重视的癌基因之一。自从1972年Kerr提出细胞凋亡（apoptosis）的概念至今，人们对细胞凋亡现象进行了广泛、深入的研究。但是，凋亡的分子和生化机制迄今尚未彻底明了，而已形成的初步认识大多源于对Bcl-2基因家族的研究。已知，凋亡进程可分为三个时相：诱导期，效应期和降解期。在诱导期，细胞接受各种信号从而引发各种不同的效应；进入效应期后，经过一些决定细胞命运（存活/死亡）的分子调控点，细胞进入不可逆的程序化死亡，这些调控分子包括一系列原癌基因和抑制癌基因的产生，其中Bcl-2家族起着决定性的作用；降解期则产生可见的凋亡现象。Bcl-2基因（即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因）是一种原癌基因，它具有抑制凋亡的作用，并且近年来的一些研究已开始揭示这一作用的机制。目前已经发现的Bcl-2蛋白家族按功能可分为两类，一类是像Bcl-2一样具有抑制凋亡作用，如哺乳动物的Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1、A1、线虫Ced-9、牛痘病毒E1B119kD等，而另一类具有促进凋亡作用，如Bax、Bcl-Xs、Bax、Bak、Bik/Nbk、Bid和Harakiri。最初在血液淋巴细胞中发现Bcl-2能抑制细胞死亡，随后陆续在其它一些细胞中也发现Bcl-2的这种作用。但近年来研究发现，除这些之外尚存在Bcl-2不敏感的凋亡途径。敏感凋亡Bcl-2可以抑制由多种细胞毒因素所引起的细胞死亡。Bcl-2的过度表达能增强所观察细胞对大多数细胞毒素的抵抗性。这一发现使人们认识到凋亡的各种信号转导途径有一个共同的通路或交汇点，而该通路或交汇点受Bcl-2调节。实验表明，Bcl-2可增强细胞对大多数DNA损伤因子的抵抗性，抑制大多数化疗药物所引起的靶细胞凋亡，但其本身并不能抑制这些因素对细胞的损伤；同样地，它也不能促进DNA修复。p53蛋白是DNA损伤的一个分子传感器，已证实Bcl-2能抑制p53介导的凋亡，但不能抑制p53向核内转位或者p53介导的生长停滞，可能Bcl-2的作用是在DNA损伤后，阻止激活凋亡机制的信号到达其靶分子；在细胞毒性T细胞中，由颗粒酶B激活Caspases家族的一个或多个半胱氨酸蛋白酶所诱导的凋亡不依赖于Bcl-2，颗粒酶B可能仅作用于凋亡路径中Bcl-2调节位点的下游。以上结果表明在凋亡途径中Bcl-2的作用位点是在信号分子和效应蛋白酶之间的位置。Bcl-2抑制细胞凋亡可能与其以下几种作用有关：①细胞催抗氧化作用以往研究表明，在去除生长因子所诱发的凋亡中，活性氧损伤（ROS）是促发细胞死亡的主要诱因：Bcl-2的过度表达可减少氧自由基的产生和脂质过氧化物的形成。提示Cai等[4]的实验表明Bcl-2的抗氧化作用是间接的，即可能在于抑制超氧阴离子的产生而不是直接清除活性氧。细胞色素c（cytochromec,Cytc）作为呼吸链中重要的电子传递体，它从线粒体内膜上的释放会阻断电子向下游传递体危及呼吸链的功能并导致超氧阴离子的加速产生；而Bcl-2可以抑制Cytc的释放，从而抑制了超氧阴离子的产生。此外，Bcl-2还可以增加胞内的谷胱甘肽（GSH）等抗氧化剂，升高NAD/NADH的比值，抑制和凋亡相联系的GSH降低，促进GSH进入核内，从而影响细胞的氧化还原状态。但也有证据表明，在没有自由基的情况下Bcl-2也能抑制凋亡。因此，Bcl-2的性质远非仅仅是一种抗氧化剂。②抑制钙离子跨膜流动Lam等曾报道钙泵特异性抑制剂Thapsigargen（TG）诱导的WEH17.2等细胞的凋亡可被Bcl-2所抑制，其原因是Bcl-2抑制了Ca2+的跨膜流动，提示Bcl-2可通过调节胞内钙离子浓度来调节凋亡。然而Wei等在神经元细胞GT1-7中发现Bcl-2中发现Bcl-2可抑制由TG所诱导的凋亡，但并不能抑制TG诱导的胞内钙离子浓度升高；同时Jason等[6]在中国仓鼠卵巢细胞5AHSmyc中去除细胞内贮存Ca2+后发现过度表达的Bcl-2仍可抑制凋亡，提示Bcl-2对胞内Ca2+浓度的调节作用也只能是其抑制凋亡的机制之一。③离子通道蛋白和吸附/锚定蛋白最近