Mate-Plate酵母双杂交文库构建中文说明书(clontech)

“Mate&Plate™”文库构建系统说明书PT4085-1(PR013451)Cat.No.630490PublishedFebruary2010“Mate&Plate™”文库构建系统说明书ProtocolNo.PT4085-1目录I.介绍&操作流程..................................................................................................4II.组份列表............................................................................................................5III.附加产品推荐...................................................................................................7IV.缩写列表...........................................................................................................8V.宿主菌株信息....................................................................................................9VI.对照实验..............................................................….……………………………………10A.总论................................................................................................……………….10B.操作:对照同源重组克隆的实验操作………………………………………………………....10VII.cDNA文库构建.............................................................................................11A.操作:第一链cDNA合成.................................................................................11B.操作:长距离PCR(LD-PCR)扩增cDNA............................................................13C.操作:CHROMASPIN™TE-400纯化dscDNA................................................14VIII.双杂交文库构建..........................................................................................16A.酵母双杂交文库构建&筛选总论...................................................................16B.操作:制作Mate&Plate文库.........................................................................16IX.参考文献.........................................................................................................18X.疑难解答指南..................................................................................................19附录A:文库滴度测定.........................................................................................24附录B:质粒信息................................................................................................22附录C:酵母生长培养基&补充物.....................................................................23附录D:SMART™技术概述................................................................................25客服/订购技术支持tel:800.662.2566(免费)tel:[phone](免费)fax:[phone](免费)fax:[phone]web::[e-mail]-mail:[e-mail]“Mate&Plate™”文库构建系统说明书＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿AClontechLaboratories,Inc.目录，续图表Figure1.利用酵母的生物学知识构建Mate&Plate文库…………..………………......4Figure2.Mate&Plate文库构建概述...................................................................11Figure3.SMARTcDNA合成高质量cDNA.............................................................14Figure4.CHROMASPIN纯化柱和收集管.............................................................15Figure5.pGADT7-Rec载体图谱和克隆位点......................................................22TableI:酵母宿主菌株的基因型.............................................................................9TableII:根据不同SD培养基的表型测试..............................................................9TableIII:RNA起始量和PCR最优循环数的相关性分析......................................13TableIV:酵母培养基套装2&酵母培养基套装2Plus的各组份………..….……........23TableV:Matchmaker黄金酵母操作用独立包装的酵母培养基.........................23TableVI:酵母双杂交筛选用的附加培养基&培养基补充物………….….….….........24“Mate&Plate™”文库构建系统说明书ProtocolNo.PT4085-1介绍&操作流程酵母双杂交系统主要是从prey文库中筛选与已知蛋白（bait）有相互作用的蛋白（prey）。鉴于传统文库构建费时费力，Clontech公司研发了Mate&Plate™文库（可以使用SMART技术自己构建酵母prey文库，也可购买预制的酵母prey文库制品）。在合适的基本选择培养基上，将酵母prey文库与bait菌株通过简单的共培养即可筛选出与已知蛋白相互作用的prey蛋白。使用“Mate&Plate™”酵母文库构建系统(Cat.No.630490)可以助你运用简单的方法构建高效的“Mate&Plate酵母文库”，原理是利用啤酒的同源重组机制(Figure1)，在Y187的酵母菌完成载体的重组，无需使用大肠杆菌克隆、扩增和筛选文库。本系统利用SMART™cDNA合成技术，能够从低至100ng的总RNA起始cDNA文库的构建(详见附录D，SMART技术概述)。Figure1.使用酵母生物学构建Mate&Plate酵母文库。Mate&Plate文库构建是在酵母中进行的，借助生物体自身的同源重组功能将cDNA克隆到pGADT7-Rec中。首先，使用SMARTcDNA合成技术合成含有与pGADT7-Rec载体末端同源的cDNA，然后，将cDNA和pGADT7-Rec转入Y187中，通过同源重组构建AD文库，最后将所有克隆收集并分装成1ml的文库用于双杂交筛选。关于本试剂盒的说明书本试剂盒的说明书介绍了怎样构建您自己的文库和分装文库。关于文库筛选的更多操作细节，请参见Matchmaker黄金酵母双杂交说明书(PT4084-1)，网址：。Matchmaker黄金酵母双杂交系统以编号630489单独销售。Matchmaker文库构建概述文库构建过程包括以下步骤(详见Figure1)：•Step1.利用SMART™技术合成cDNA。•Step2.将cDNA和线性化的pGADT7-Rec载体共转化酵母菌株Y187，然后在SD/–Leu固体培养基上培养Y187。•Step3.培养4–5d，然后将所有的酵母克隆收集到营养丰富的液体培养基中。•Step4.平均分成2份，然后冻存。•Step5.使用单独的1ml文库筛选[详见Matchmaker黄金酵母双杂交系统]。“Mate&Plate™”文库构建系统说明书＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿AClontechLaboratories,Inc.组份列表“Mate&Plate”文库构建说明书(Cat.No.630490)本试剂盒包含构建5个AD酵母文库的足够试剂（组份列表如下）。将袋装的酵母培养基,去离子H2O,CHROMASPIN™纯化柱,NaCl溶液,NaOAc,LiAc,PEG,TE缓冲液,和YPDPlus培养基放置于室温保存。将酵母菌株，对照PolyA+RNA和SMARTIIIOligo置于–70℃保存。将其他所有试剂置于-20℃保存。第一链cDNA合成•10μlSMARTIIIOligo(10μM;5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3’)注意:SMARTIIIOligo是经过修饰的。•10μlCDSIII引物(10μM;5’-ATTCTAGAGG