布鲁氏菌病诊断技术规程

布鲁氏菌病诊断技术规程(NY／SY161-2000)1．范围本规程规定了布鲁氏菌病虎红平板凝集试验、试管凝集试验、全乳环状反应试验和补体结合试验，适用于布鲁氏菌病的检疫。2．虎红平板凝集试验2.1试剂布鲁氏菌病虎红平板凝集抗原，标准阳性、阴性血清，由中国兽药监察所生产。2.2操作方法2.2.1备一块洁净玻璃板，画成若干个4cm2小格。或直接使用虎红平板凝集试验卡片。2.2.2取被检血清和抗原（抗原使用前应充分摇匀）各一滴（约30µ1）等量混合，充分摇匀，在4分钟内读取结果，同时作阴、阳性对照。2.2.3被检血清在规定时间内出现凝集反应者判为阳性，不出现凝集者为阴性。2.2.4本试验出现阳性反应的动物，需经补体结合试验或其他辅助试验方可定性。3．试管凝集试验3.1试剂3.1.1抗原，阳性血清、阴性血清，由中国兽药监察所生产。3.1.2试验用稀释液：石炭酸生理盐水，用化学纯石炭酸5g和化学氯化钠8.5g加至1000毫升蒸馏水中制成，经高压灭菌后备用。3.2操作方法被检血清必须新鲜，无明显蛋白凝固，无溶血现象和腐败气味。3.2.1被检血清的稀释：一般情况，牛、马和骆驼用1：50，1：100，1：200和1：400四个稀释度；猪、山羊、绵羊和狗用1：25，1：50，1：100，1：200四个稀释度。大规模检疫时也可用两个稀释度即牛、马和骆驼为1：50和1：100；猪、山羊、绵羊和狗1：25和1：50。3.2.2血清稀释（以羊、猪为例）和加人抗原的方法每份血清用5支小试管（口径8～10毫米），第一管加人2.3m1石炭酸生理盐水，第二管不加，第三、第四和第五管各加入0.5ml。用lml吸管吸取被检血清0.2m1，加人第一管中，并混合均匀。混匀后，以该吸管吸取混合液分别加人第二管和第三管，每管0.5ml。以该吸管将第三管的混合液混匀吸取0.5ml加人第四管混匀后，又从第四管吸出0.5ml加人第五管，第五管混匀完毕弃0.5ml。如此稀释之后从第二管起血清稀释度分别为1：12.5、1：25、1：50和1：1000血清规定用0.5％石炭酸生理盐水稀释，但检验羊血清时用0.5％石炭酸10%盐水溶液稀释。加人抗原的方法：先以0.5％石炭酸生理盐水将抗原原液作20倍稀释（如果血清用0.5％石炭酸10％盐水溶液稀释则抗原原液亦用0.5％石炭酸10％盐水稀释），然后加人上述各管（第一管不加，留作血清蛋白凝集对照），每管0.5ml，振摇均匀，加人抗原后，第二管至第五管各管混合液的容积均为1ml，血清稀释度从第二管起依次变为：1：25，1：50，1：100和1：200。牛、马和骆驼血清稀释和加抗原法：具体方法与上述一致，不同的是，第一管加2.4m10.5％石炭酸生理盐水和0.1m1被检血清，加抗原后从第二管到第五管血清稀释度为1：50，1：100，1：200和1：400。3.2.3对照管的制作每次试验须作三种对照各一份。阴性血清对照：阴性血清的稀释和加抗原的方法与被检血清同。阳性血清对照：阳性血清对照须稀释到其原有滴度，加抗原的方法与被检血清相同。抗原对照（了解抗原是否有自凝现象）：加1：20抗原稀释液0.5m1于试管中，再加0.5m10.5％石炭酸生理盐水（如果血清一用0.5%石炭酸10％盐水溶液稀释则也加人0.5％石炭酸10%盐水溶液）。3.2.4比浊管的制作每次试验须配制比浊管作为判定清亮程度（凝集反应程度）的依据，配制方法如下：取本次试验用的抗原稀释液（即抗原原液的20倍稀释液）5～l0ml加人等量的0.5％石炭酸生理盐水（如果血清用0.5％石炭酸10%盐水稀释，则加人0.5％石炭酸10％盐水溶液）作对倍稀释，然后按下表配制比浊管。表13－1管号抗原稀释液（ml）石炭酸生理盐水（ml）清亮度标记10.01.0100％＋＋＋＋20.250.7575％＋＋＋30.500.5050％＋＋40.750.2525％＋51.00.00％－3.2.5全部试管于充分振荡后置于37℃～38℃恒温箱中22～24小时，然后检查并记录结果。3.2.6记录结果根据各管中上层液体的清亮度记录凝集反应的强度（凝集价），特别是50％清亮度（即“＋＋”的凝集）对判定结果关系很大，需用比浊管对照判定。＋＋＋＋：完全凝集和沉淀，上层液体100％清亮（即100％菌体下沉）。＋＋＋：几乎完全凝集和沉淀，上层液体75％清亮。十＋：沉淀明显，液体50％清亮。＋：无沉淀，液体25％清亮。确定每份血清的效价时，应以出现“＋＋”以上的凝集现象（即50％的清亮）的最高血清稀释度为血清的凝集价。3.3结果判定3.3.1牛、马和骆驼于1：100稀释度，猪、山羊、绵羊和狗于1：50稀释度出现“＋＋”以上的凝集现象时，被检血清判定为阳性反应。牛、马和骆驼于1：50稀释度，猪、山羊、绵羊和狗于1：25稀释度出现“＋十”以上凝集现象，被检血清判定为可疑反应。3.3.2可疑反应的牲畜，经3～4周，须重新采血检验。在牛和羊，如果重检时仍为可疑，该畜判定为阳性；在猪和马重检时，如果凝集价仍然保持可疑反应水平，而农场的牲畜没有临床症状和大批阳性反应的患畜出现，该血清判定为阴性。3.3.3鉴于猪血清常有个别出现非特异性凝集反应，在试验时须结合流行病学判定结果。如果被检血清中有个别出现阳性反应（例如凝集价为1：100～1：200)，但猪群中所有的猪只均无布氏杆菌临床症状（流产、关节炎、肇丸炎等），可考虑此种反应为非特异性，经3～4周可采血重检。4．全乳环状反应试验4.1试剂吐布鲁氏菌病全乳环状反应抗原，标准阳性、阴性血清，由中国兽药监察所生产。4．2操作万法取牛新鲜全乳lml于小试管内，加人本抗原1滴（约50µ1)，充分混合，置37℃温箱中作用1小时，取出读取结果。4．3结果判足十＋＋：强阳性反应：乳柱上层乳脂形成明显红色环带，乳柱白色，临界分明。十＋：阳性反应：乳脂层呈红色，但不显著，乳柱略带颜色。＋：弱阳性反应：乳脂层环带颜色，乳柱小褪色。士：疑似反应：乳脂层环带颜色不明显。5．补体结合试验5.1试验材料5.1.137℃水浴箱，普通离心机，普通冰箱，吸管，凝集试验管，试管架等。5.1.2稀释液：生理盐水。5.1.3溶血素：由兽医生物药品厂生产提供。5.1.4补体：选择健康豚鼠3～5只，于使用前一天早晨饲喂前或停食后6小时从心脏采血，分离血清后混合保存于普通冰箱中，也可从兽医生物药品厂购买冻干补体，使用前加稀释液恢复原量后使用。表13－2各种被检动物血清的灭能温度和时间血清类别灭能温度（℃）灭能时间（分钟）羊58～5930马58～5930驴、骡63～6430黄牛、水牛、猪56～5730骆驼54305.1.5绵羊红细胞悬液：采取成年公绵羊血，按常规方法脱纤、洗涤、离心，用稀释液洗涤3～4次，最后一次以2000r/min离心沉淀10分钟，取下沉的红细胞，以稀释液配制成2.5％红细胞悬液。5.1.6阴、阳性血清对照：由兽医生物药品厂提供。5.1.7抗原：由中国兽药监察所生产。5.1.8被检血清以常规方法采血和分离血清，用稀释液将血清作1：10稀释，按表13-2规定在水浴箱中灭能。5．2预备试验正式试验前，将试验的各种成分进行测定。5.2.1溶血素效价测定5.2.1．1稀释溶血素取0.2m1含等量甘油防腐的溶血素，加9.8ml稀释液配成1：100的基础稀释液，按表13-3方法作进一步稀释。5.2.1.2按表13-4加入各成分，而后37～38℃水浴20分钟。表13-3溶血素稀释法单位：ml管号12345678910111：100溶血素0.20.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1稀释液0.80.91.41.92.42.93.43.94.44.95.4溶血素稀释倍数50010001500200025003000350040004500500055005.2.1.3溶血素效价从水浴中取出，立即判定结果，用1：20补体0.5m1在37～38℃水浴20分钟，能使2.5％红细胞液0.5m1完全溶血的最小睡量溶血素为溶血素效价或称一单位溶血素。表13-4为例，对照管均不溶血，1～6管完全溶血，测定溶血素效价为3000倍。正式试验时溶血素的工作效价为滴度效价的倍量或称二单位溶血素，表13-4为例，工作效价为1500倍。价测定后，2～3个月内可按此效价使用，不必重测。5.2.2补体效价测定每次补体结合试验，应于当日测定补体的效价。5.2.2.1稀释补体并加各种成分用稀释液配制1：20稀释补体，按表13-5加人各种成分后，前后经37～38℃水浴20分钟2次。表13－4溶血素效价测定表单位：ml管号1234567891011对照管溶血素补体稀释液溶血素稀释倍数50010001500200025003000350040004500050005500100加入量0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.500稀释液1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.51.52.01：20补体0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.500.502.5％红细胞0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.537～38℃水浴20分钟结果（例）－－－－－－＋＋＋＋＋＋＋＃＃＃＃全部溶血部分溶血全部不溶血5.2.2.2补体效价经过2次水浴，在2单位溶血素存在的情况下，阳性血清加抗原的试管完全不溶血，而在阳性血清未加抗原及阴性血清无论有无抗原的试管发生完全溶血所需要最小补体量，就是所测得的补体效价。表13-4为例，第6管1：20稀释的补体0.25m1，即为一个补体单位。5.2.2.3原补体在使用时应稀释倍数的计算原补体应稀释倍数＝（补体稀释倍数/测得效价）×使用时每管加入量。表13-5为例，按公式计算（20/0.25)×0.5=40倍。即此例补体应作40倍稀释，每管加0.5ml，即为一个补体单位。考虑补体性质不稳定，操作过程中效价会降低，正式试验时使用浓度比补体效价要大10％左右，本例补体工作单位应作1：36稀释，每管使用0.5m1。5.2.3抗原效价测定一般按照兽医生物制品厂产品说明书的效价使用。在初次使用或过久等原因需要测定时，按下述步骤进行。5.2.3.1须取用二份阳性血清（分别为强阳性和弱阳性血清）和一份阴性血清来测定抗原效价。5.2.3.2阴性血清和阳性血清稀释用稀释液对阴性对照血清作1:10稀释，阳性对照血清稀释成1：10，1：25，1：50，1：75和1：100等5个稀释度。5.2.3.3稀释抗原用稀释液将抗原稀释成1：10，1：50，1：75，1：100，1：150，1：200，1：300，1：400和1：500等稀释度。5.2.3.4按表13-6加人各种成分并经37～38℃水浴20分钟2次。5.2.3.5记录抗原测定结果从水浴中取出反应管，观察溶血百分数，记录结果。（溶血程度的标准比色管配制见5.3.4)例举范例如表13-7。表13－5补体效价测定单位：ml管号12345678910对照1112131：20补体加入量0.100.130.160.190.220.250.280.310.340.370.500稀释液加入量0.400.370.340.310.280.250.220.190.160.131.51.52.0工作量抗原加入量（不加抗原管加稀释液）0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.500010倍稀释阳（阴）性血清0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5000振荡均匀后，37～38℃水浴20分钟二单位溶血素0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.500.502.5％红细胞悬液0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5振荡均匀后，37～38℃水浴20分钟结果（例）阳性血清加抗原＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃＃阳性血清不加抗原＃＃＋＋＋＋＋＋－－－－－阴性血清加抗原＃＃＋＋＋＋＋＋－－－－阴性血清不加抗原＃＃＋＋＋＋＋＋－－－