定性定量方法修改

IHSS定性提取方法称取过2mm筛风干土样100g加入玻璃瓶(2.5L玻璃瓶①)中,按土水比1:1加入1mol/L的HCl(如仍冒泡则按1:2),放置1h,用0.1mol/L的HCl调至最终土水比1:10.室温摇动玻璃瓶1h(10min/次),将混合液倒入大离心管中,低速离心,上清液(FA1)倒入FA瓶(2.5L塑料瓶)中备用.(1D)碱提步骤：用0.1mol/L的NaOH将沉淀冲到玻璃瓶①中,并调至最终土水比1:10，用1mol/L的NaOH调节pH=13~14,立即充氮气(1min)并盖严.保持氮气条件下(盖严)摇动玻璃瓶,1h或0.5h一次,持续12h后静置过夜.次日低速离心,上清液倒入HE(HA+FA2)瓶(2.5L玻璃瓶②)中,用6mol/L的HCl将HE瓶中液体酸化(pH=1.0).碱提步骤(下划线)重复3次.重复3次后将沉淀水洗至适当容器中,50℃烘干,以提取Hu备用(Hu提取完毕).絮凝步骤：第三次酸化后的HE放置12~16h,用虹吸法将上清液(FA2)吸入FA瓶,之后低速离心,上清液为FA2(虹吸残留),将上清液倒入FA瓶中(FA提取完毕),沉淀为HA.氮气条件下在大离心管中用最少量(记录所用体积)0.1mol/L的KOH溶解HA,之后用适量1mol/L的KOH调节pH=13~14.加入计算好的固体KCl(KCl用量见附表1),使K+浓度为0.3mol/L(如无絮凝则需微量添加),静置1h后,将溶液移至高速离心管,高速离心,保留上清液,弃掉悬浮物.酸洗步骤：搅拌条件下用6mol/L的HCl调节上清液pH=1.0,放置12~16h,高速离心后弃掉上清液.在高速离心管中用30ml的HCl(0.1mol/L)+HF(0.3mol/L)【8.3mLHCl+24.87mLHF→1000mL】浸泡HA,室温下振荡过夜后高速离心,弃掉上清液.酸洗步骤(斜体)重复3次.必要的话，洗至灰分含量小于1%.用水将沉淀搅拌成泥状,之后电渗析直到蒸馏水中无Cl-(AgNO3检测),冻干备用(HA提取纯化完毕).注解注1:①和②为玻璃瓶组号注2:室温条件为25℃注3:低速离心为4000r/min,15min,离心管为大离心管,250ml注4:高速离心为11000g,15min,离心管为高速离心管,30ml所需药品1、盐酸HCl:0.1mol/L（8.3mL→1000mL）,1mol/L,6mol/L（500ml→1000mL）2、氢氧化钠NaOH:0.1mol/L,1mol/L3、固体KCl4、氢氧化钾KOH:0.1mol/L（5.6g→1000mL）5、氢氟酸HF:0.3mol/L（24.87mL→1000mL）HCl(0.1mol/L)+HF(0.3mol/L)【8.3mLHCl+24.87mLHF→1000mL】附表10.1MKOH=0.4L0.1MKOH=0.5L0.1MKOH=0.6L0.1MKOH=0.7L1MKOH(L)KCl(g)1MKOH(L)KCl(g)1MKOH(L)KCl(g)1MKOH(L)KCl(g)0.0104.0880.0105.2080.0106.3280.0107.4480.0203.6960.0204.8160.0205.9360.0207.0560.0303.3040.0304.4240.0305.5440.0306.6640.0402.9120.0404.0320.0405.1520.0406.2720.0502.5200.0503.6400.0504.7600.0505.8800.0602.1280.0603.2480.0604.3680.0605.4880.0701.7360.0702.8560.0703.9760.0705.0960.0801.3440.0802.4640.0803.5840.0804.7040.0900.9520.0902.0720.0903.1920.0904.3120.1000.5600.1001.6800.1002.8000.1003.9200.1100.1680.1101.2880.1102.4080.1103.5280.1200.8960.1202.0160.1203.1360.1300.5040.1301.6240.1302.7440.1400.1120.1401.2320.1402.3520.1500.8400.1501.9600.1600.4480.1601.5680.1700.0560.1701.1760.1800.7840.1900.3920.2000.000（1）将粗HM烘半干、称重，均匀分成4份，置于离心管（100mL）中，加入0.5%(v/v)的HF-HCI混合液约50ml,用玻璃棒搅匀,在恒温（水浴）振荡机上振荡12小时(25℃,145-175rpm/min)，次日取出离心15分钟(3500r/min),然后将离心后的上清液弃去,继续重复上述处理6次，即依次用0.5%(v/v)的HF-HCI混合液连续处理7次。（2）用2.5%(v/v)的HF-HCI混合液连续处理7次；振荡、离心同上。（3）用5%(v/v)的HF-HCI混合液连续处理11次;振荡、离心同上。（4）用10%(v/v)的HF-HCI混合液连续处理6次，振荡、离心同上。（5）用20%(v/v)的HF-HCI混合液连续处理4-8次;振荡、离心同上。（6）用30%(v/v)的HF-HCI混合液连续处理2次;振荡、离心同上。（7）用40%(v/v)的HF-HCI混合液处理1次，振荡、离心同上。总共用不同浓度的HF-HCI混合液处理33-37次，前8次分别向每个离心管加入4gNa2SO4·10H2O，将经HF-HCI混合液处理后的HM用蒸馏水(25-50ml/管)洗至无氯离子反应(共洗3-6次，用AgNO3检查),然后用冷冻干燥机冻干备用。定量：腐殖质组成修改法（包括胡敏素提取）（1天）提取：1、称取风干土（60目）5.00g于100ml离心管（事先标号称重），土用百分之一天平称。2、按照土比水1/6加入蒸馏水（即30ml,用注射器，20+10ml）。3、搅拌均匀后，用恒温水浴振荡器（70±2度、145转/分）震荡提取1h。4、取下后以3500转/分离心15分钟，将上清液用中速定量滤纸过滤到50ml容量瓶中。5、再用蒸馏水洗残渣1次（10+10）ml将离心液过滤到50ml容量瓶中，用蒸馏水定容，此部分为水溶性物质——WSS.（WSS测吸光值400、465、600、665nm用723可见光分光光度计，做TOC.）分离：一、HE（HS）与HM的分离1、离心管中残渣加入（20+10）ml0.1NNaOH与0.1mol/LNa4P2O7•10H2O(pH=13)混合液，玻璃棒搅拌均匀。2、在恒温水浴振荡器上70±2度145转/分震荡，提取1h。3、取下后，以3500转/分离心15分钟，将上清液用中速定量滤纸过滤到50ml容量瓶中。4、再用混合液洗残渣1次，（10+10）ml，将离心液过滤到50ml容量瓶中，蒸馏水定容，此为可提取腐殖物质——HE5、离心管中的残渣用（20+10）ml蒸馏水洗2-3次并3500转/分离心15分钟，弃去液体，此时离心管中为胡敏素——HM（Hu）（粗）.二、HA与FA的分离1、吸取上述碱提取液(HE)30ml于50ml小三角瓶中，加入1NH2SO4,调节pH为1.0-1.5。(加4管左右酸，溶液颜色会变化)【HE取出30ml后剩余约10ml先不倒掉，以备TOC仪器故障时，取5ml，电热板定碳（先中和、蒸干、定碳）。FA=HE-HA】2、将此溶液于60-70度（67）下水浴锅中保温1-2h,然后静置过夜。（2天）3、次日，将溶液用中速定量滤纸过滤，分离出沉淀为HA,溶液为FA用水定溶（FA测吸光值，上TOC）。吸FA10ml于50ml容量瓶中，调ph为7，定容，可测TOC,TOC小瓶装满排号）4、用0.05NH2SO4洗涤沉淀（HA）3次于50ml锥形瓶中，每次用5-8ml（7.5ml）（注射器），弃去洗液。5、将HA沉淀用温热的(60度，最好在水浴锅旁恒温加热冲洗)0.05NNaOH溶解于另一组50ml容量瓶中（3次，20+10+10ml），用0.05NNaOH定容——HA(HA测吸光值，稀释5-10倍.上TOC).如TOC仪器故障时，取5-10ml，电热板定碳（先中和、蒸干、定碳）。FA=HE-HA】三、HMi与HMc的分离1、粗HM用(15+10)ml1NH2SO4搅拌25°C振荡2h,以4000r/min离心15min,弃去液体。2、用水洗残渣2次，每次用蒸馏水50ml,以4000r/min离心15min,弃去液体。3、HMi:加入0.2molNaOH50ml，25°C振荡1h,室温静止24h。4、以4000r/min离心15min,过滤到50ml容量瓶中用蒸馏水定容——HMi.（HMi测吸光值，HMi稀释5倍。定碳）5、向残渣中加入1mol/LHF+HCl溶液处理2次，每次用50ml25°C振荡2h,以4000r/min离心15min,弃去液体.6、加入50ml1mol/LHF搅拌均匀在25°C恒温水浴上振荡2h,之后以4000r/min离心15min,弃去液体。7、用蒸馏水洗残渣2次，每次用50ml,搅拌均匀后以4000r/min离心15min,弃去液体。8、HMc:加入0.2ml/LNaOH50ml,25度振荡1h,室温静止24h.9、以4000r/min离心15min,过滤到50ml容量瓶中用蒸馏水定容，即为HMc.（测吸光值，稀释2.5倍。定碳）10、HMr:残渣用50ml蒸馏水洗并4000r/min离心2次，弃去液体，离心管中剩余的残渣IDH(HMr)烘干（50-60度）后称重（4位电子天平），过60目筛。上TOC11、最后在离心管中倒入重铬酸钾浸泡后刷开净。0.2M（N）FeSO4溶液：称取硫酸亚铁56g溶于水，加6NH2SO430ml，定容到1L.