定量PCR应用

1定量PCR技术的应用刘海生2ABI定量PCR发展史1996，第一代，世界上第一台定量PCR——77001997，第二代，57002000，第三代，金标准——79002003，AB获得荧光定量PCR仪器专利2001，第四代，70002004，第五代产品，7300&75002007，第六代产品，StepOne&StepOnePlus2010，第七代产品，ViiA7高产率荧光定量PCR仪3ABI具有的Real-TimePCR相关的知识产权•PCR仪器专利•定量PCR仪器专利•VICdye•TaqManMGB探针4•秉承ABI二十多年PCR仪制造经验，提供最稳定的性能•基于Peltier技术Block的PCR控温系统，保证可靠的PCR扩增过程•一体化整机设计，光学部分与热循环部分结合成仪器整体，避免震动及实验室环境光线干扰引起的光学误差。•有效区分2倍差异，有效检测10个拷贝以上的模板量，最低检测一个拷贝的起始模板量。•试剂和耗材完全开放•一个平台多种应用：mRNA，miRNA，SNP，CNV，稀有突变检测和蛋白表达分析。ABI定量PCR系统设计特点5有效区分两倍差异的模板6采用多组分运算的专利技术•定量过程要求每种染料的真实荧光必须能被辨别区分所有其他产品使用较窄的滤光片组来分辨染料要求光谱分离极好的染料以避免干扰•AB具有两种机制滤光片或光栅多组分算法•多组分算法使用每种染料的已知光谱来校正叠加干扰，因此定量真实允许使用较宽的滤光片以收集更多的光提高信噪比提高灵敏度020406080100460480500520540560580600620激发效果020406080100460480500520540560580600620激发效果窄宽7StepOne™Plus领先的触摸彩屏设计——脱离电脑独立操作StepOnePlusReadytogo8StepOne™Plus:四色荧光系统•最实用的4色系统−FAM™/SYBR®Greendyes-应用最广泛的单重基因检测荧光−VIC®/JOE™dyes-双重基因检测时，与FAM是最佳组合−ROX™dye-检测系统故障和校正加样误差，保证实验的精确性−NED™/TAMRA™dye-三重基因检测时，与FAM和VIC是最佳组合9StepOnePlus™:加热模块兼具标准和快速模式4●96-孔Block-同一个Block，两种速度可选–快速模式：40分钟完成40个循环–标准模式：2小时完成40个循环–10-30µl反应体积10StepOnePlus™:加热模块●Veriflex™Block-一个Block，六个温控区-与Veriti™96-孔PCR仪相同的“Betterthangradient”性能*ImagefromVeritiThermalCycler117500/7500Fast实时荧光定量PCR仪•2004年全年，出于生物反恐的目的，美国国防部和邮电部共购买了75台荧光定量PCR仪，全部为ABI公司之产品•7500通过美国FBI认证•7500通过21CFRPart11实验室认证•7500正在成为工业化平台标准（DuPont,Abbott,…)•7500FastDxReal-TimePCR仪获FDA正式批准与美国疾控中心新流感检验试剂配套联用127500/7500Fast系统特点•五个激发光滤光片•五个检测光滤光片•滤光片适用于更广泛的波长检测范围−FAM™,SYBR®GreenI−VIC™,JOE™−NED™,TAMRA™,CY3Dye™.−ROX™(passivereference),TexasRed®−CY5Dye™•软件配有多组分算法去除荧光之间的干扰•无需校正光源能量差•兼具标准和快速反应模式137900HT定量PCR仪•金标准的定量PCR仪：激光激发+光栅分光+CCD检测（最低可以做到1ul反应体系）•高精度验证OpenArray或MicroArray扫描得到的少量基因，microRNA或ＳＮＰ位点的理想工具•专门用于少量位点大量样本的定量PCR应用研究•一个平台多种应用——病原体检测，SNP分型，mRNA（单个和信号通路），microRNA（单个和microRNA表达谱），Pri-miRNA，CNV等14•灵活、有弹性−384孔定量PCR微流体芯片模块（~1ul）−384-well(5-20µL)−96-wellFast(10-30µL)−96-well(20-100µL)•用户自行更换，5min内完成更换•Block更换后不需要重新校正7900HT定量PCR仪：灵活多样15AB第7代实时荧光定量ＰＣＲ仪－ＶｉｉＡ７开启高产率荧光定量PCR新时代•速度快，通量高。35分钟完成384个定量PCR反应。•多重荧光能力增强：6色激发光通道和6色检测光通道自由组合，可检测21种荧光。支持同管多重基因表达实验（同管双基因检测），同管多重SNP分型实验(同管双SNP位点，4重荧光）•操作简便。直观的软件，内置触摸屏电脑，网络远程操控，自动机械臂进样装置。•结果可靠：孔间差异，批间差异，以及仪器间差异降至最低。创新的OptiFlex™系统的增强型荧光检测提供21种荧光组合，具有更高的多重分析灵活性，更高的分辨率，能获得更准确的数据。•多模块灵活性。可轻松更换标准96孔，快速96孔，384孔，和TaqMan®微流体芯片4种模块。。16ViiA™7Real-TimePCRSystem“RedefiningtheMarket–UnsurpassedProductivity&Convenience”•全新光路系统•新的软件算法•在TaqManArray操作中比原先省略60%操作步骤•快速Block模块更换•内置触摸屏电脑方便创新产率•与ReadiApp™功能无缝连接•远程网络操控17多种应用选择，指尖轻易操控●预设置各种不同应用的标准程序，一键式触摸选择，ReadiApp™软件功能●轻松上传TaqMan®Assay信息和样品信息●方便下载新的试剂操作程序18内置触摸屏电脑-双重数据存储•NametheinstrumentandcreateanAvatar•Createshortcutstocommonprotocols•On-boardtimertoindicatetimetocompletion适合中心实验室或多用户的客户19最灵活的光路技术OptiFlex™System•灵敏度和均一性−读取384-wells1uL反应体系(TaqMan®ArrayCards)−可分辨1.5倍差异−重复性可靠:批间差异和仪器间差异降至最低•有史以来最好的多重荧光（Multiplex）能力−6个激发光通道和6个检测光通道，可自由组合，检测21种荧光−可在同一块板同时完成TaqMan®和SYBR®检测204种Block模块轻松切换•更换Block只需不到1分钟−热盖(96vs.384)−反应板适配器(96vs.384vs.TAC)•384-孔Block；TaqMan微流体芯片Block•标准96-孔Block；快速96-孔BlockValidatedProgrammable3845-20uL1-30uLTAC1uL1uLValidatedProgrammable9610-100uL1-200uLFast965-30uL1-100uL21AppliedBiosystems7900HTFastReal-TimePCRSystemAppliedBiosystems7500FastReal-TimePCRSystemAppliedBiosystems7300Real-TimePCRSystemAppliedBiosystems7500Real-TimePCRSystemAppliedBiosystemsStepOne™&StepOnePlus™Real-TimePCRSystemAppliedBiosystemsViiA7ViiA7Real-TimePCRSystemAB引领Real-TimePCR发展潮流22报告内容•定量PCR芯片(TaqManArray)技术分析mRNA,miRNA,SNP−mRNA检测芯片(TaqManGeneExpressionArray/Plate)与肿瘤生物标记物分析−miRNA检测芯片(TaqManMicroRNAArray)与肿瘤生物标记物分析−药物代谢酶SNP基因分型芯片(TaqManDMEgenotypingArray)与药物基因组分析•定量PCR方法分析基因拷贝数多态(copynumbervariation)−TaqManCNV分析试剂盒，在疾病易感基因分析应用•定量PCR方法分析蛋白表达−TaqMan蛋白表达分析试剂盒23基因研究平台少量样本数更多样本数少量基因Genome-wideSurvey10,000基因Pathwayfocesedsurey30-1000基因•SOLiD•全基因组mRNA/小RNA检测•发现新RNA分子•高密度全基因组杂交芯片microArray•全基因组检测已知mRNA•低密度TaqManArray•单个信号通路/基因家族/疾病关联基因/microRNA检测•个别基因real-timePCR检测TaqManArrays24ABI专利的TaqMan®-MGB探针检测技术5’3’5’5’3’5’ForwardPrimerReversePrimerTaqMan®-MGBProbeR•NFQ淬灭基团无荧光背景•MGB(小沟结合物)增加Tm值，提高特异性，可以区分一个碱基差异•AB所有SNP，mRNA，microRNA，CNV检测试剂盒都是Taqman-MGB产品•PCR反应条件一致，扩增效率一致，无需优化条件。NFQMGB25ABITaqMan分析试剂盒(Assays)家族•mRNA分析试剂盒(基因表达)：TaqManGeneExpressionAssays(超过1,200,000个预设计试剂盒，覆盖19个物种)•miRNA分析试剂盒：TaqManMicroRNAAssays(Sangerv16.0数据库)•SNP分析试剂盒(基因分型)：TaqManSNPGenotypingAssays(超过4,500,000个人类预设计分析试剂盒)−DME(药物代谢酶)SNP分析试剂盒：2600个SNP位点，分布在220个药物代谢酶基因位点上的.•CNV基因拷贝数分析试剂盒：TaqManCopyNumberAssays(超过1,600,000个人类预设计分析试剂盒)•蛋白表达分析试剂盒：TaqManProteinExpressionAssays(4种hESC多功能性标志物蛋白分析试剂盒，2个对照蛋白分析试剂盒)•非编码RNA分析试剂盒：TaqManNon-codingRNAAssays(涵盖3个物种，共24,562个已知非编码RNA)•Pri-miRNA分析试剂盒：TaqManPri-miRNAAssays(涵盖3个物种，共1,291个pri-miRNA)所有TaqManAssaysPCR反应条件一致，扩增效率一致26报告内容•定量PCR芯片技术分析mRNA,miRNA,SNP−mRNA检测芯片(TaqManGeneExpressionArray/Plate)与肿瘤生物标记物分析−miRNA检测芯片(TaqManMicroRNAArray)与肿瘤生物标记物分析−药物代谢酶SNP基因分型芯片(TaqManDMEgenotypingArray)与药物基因组分析•定量PCR方法分析基因拷贝数多态(copynumbervariation)−TaqManCNV分析试剂盒，在癌症易感基因分析应用•定量PCR方法分析蛋白表达−TaqMan蛋白表达分析试剂盒271,200,000预设计TaqMan®GeneExpressionAssaysHuman207,000Mouse184,000Rat150,000Drosophila40,000Arabidopsis97,000C.elegans90,000Canine6,500RhesusMonke