实时荧光定量PCR实验结果分析.

实时荧光定量PCR实验结果分析邓椋爻技术支持广州市昊洋贸易有限公司定量分析•绝对定量•相对定量定量PCR应用定性分析•SNP分析，基因扫描•阴阳性判定•熔解曲线分析绝对定量：HowMany–优点：给出目标基因初始模板的绝对数量，数据容易处理–缺点：必须有标准品，做标准曲线–应用：病毒拷贝数；转基因的拷贝数；转基因成分百分含量检测绝对定量与相对定量相对定量:HowMuch–优点：需要/不需要标准品；使用广泛–缺点：数据理解困难–应用：差异表达分析；芯片评估14500copies00.511.522.5NormalTreatmentATreatmentB108106102104绝对定量108106102104T绝对定量绝对定量108106102104T绝对定量105copies/well绝对定量1/3Blank1/31/31/31.11ng/2ul0.37ng/2ul0.12ng/2ul10.0ng/2ul3.33ng/2ul相对定量TControlCT=21.3SampleACT=22.8SampleBCT=19.3相对定量ControlCT=21.3=1.5ng/tube1SampleACT=22.8=0.5ng/tube0.33SampleBCT=19.3=6.0ng/tube4Fold相对定量相对定量数据处理•管家基因校准(NormalizationGene)–得出每个细胞中的[目的基因]–目标基因vs.管家基因•对照样品校准(CalibratorSample)–得出相对于某个样品的基因表达量,1Xsample.–处理的vs.未处理的，6hrvs.0hr,病理vs.正常….目标基因管家基因处理后处理前ERBB2GAPDHSampleCalibrator按比例稀释标准品，根据标准曲线确定样本初始模板浓度至少需要两个标准曲线GOI≥referencegene标准曲线确定反应扩增效率相对定量——标准曲线相对定量相对定量：∆∆CT法•依据：平均相对含量%=2–平均ΔΔCT•数据处理：△C（t）GOI-△C（t）ref=△C（t）△C（t）sample-△C（t）calibrator=△△C（t）•好处：不做标准曲线•应用范围：扩增效率较高，目标基因和内标基因扩增效率一致并且相互独立扩增；不做标准曲线，高通量检测（芯片评估）；不要求很高的精度应用实例-基因表达分析利用TaqMan技术研究ERBB2在乳腺肿瘤组织标本中的表达差异实验设计流程RNA提取RT-qPCR实验结果分析RNA定量反转录(RT)设计qPCR实验方法AurumTotalRNAkitiScriptcDNASynthesisKit材料和方法•已知在50%的乳腺肿瘤样本中，ERBB2表达异常，因此可以作为一个检测标准•选用GAPDH作为内标基因－FAM标记的ERBB2探针－VIC标记的GAPDH探针•标准品（质粒）构造标准曲线•多重PCR反应•阴性对照－无RNA对照（空白）－无逆转录酶对照（监控基因组污染）RNA定性及定量分析Experion™RNAStdSensChip5-500ng/ml100-6,000ntExperion™RNAHighSensChip0.1-5ng/ml100-6,000nt乳癌组织RNA正常乳腺组织RNA5hr.at90°CIntactIntact7hr.at90°CIntact7hr.degradationGAPDHgeneIntact5hr.degradation一步法＆两步法在不同的反应管中运行RT&PCR1.反转录反应加热灭活反转酶2.PCR反应2.PCR反应1.反转录反应1.25°C5min2.42°C30min3.85°C5min4.冷却至4°CiScriptcDNASynthesisKit设计qPCR实验方法1.定性条件摸索2.荧光化学物质•SYBRGREEN染料•Taqman探针3.定量PCR条件优化4.单双通道相互验证Fam标记目标基因探针VIC标记看家基因探针动态温度梯度5-6oCBelow10oCAbovePCR优化-温度确定预设退火温度PCR优化-熔解曲线}RealannealingrangePCR优化-扩增曲线RT-qPCR实验95ºC,15min94ºC,15sec60ºC,1minplatereadgotostep3,39moretimes10ºC,foreverEnd•目标基因：未知样品•生成标准曲线：标准品梯度•监控系统故障：阳性对照􀂾•监控污染：阴性对照/基因组对照􀂾•校准生物学误差：看家基因􀂾•降低其余误差：重复实验结果分析-绝对曲线Color2-VICdetectionforGAPDHColor1–FAMdetectionforERBB2结果分析-单双通道相互验证ERBB2单双通道相互验证的实验结果A.MultiplexReactionsHealthyRNACarcinoma28.4826.4228.6826.9828.7826.9828.65±0.1526.80±0.32B.SingleplexreactionsHealthyRNACarcinoma28.6727.0928.7126.6828.7326.7028.70±0.0326.82±0.24结果分析-扩增曲线样品扩增：正常vs肿瘤PMT1-FAMdetection-ERBB2PMT2-VICdetection-GAPDH肿瘤肿瘤正常HealthyRNATumorRNAGAPDHERBB210951052213024929550085730136000130800Copiesng/µlTotalRNAERBB2copies/GAPDHcopies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.0197HealthyRNATumorRNA0.0110.0180.018/0.011＝1.63HealthyTissueCarc.TissueRelativeExpression00.20.40.60.811.21.41.61.82结果计算-双标准曲线结果计算-2-ΔΔc(t)法ΔΔC(t)=4.41-5.18=-0.77±0.182-ΔΔc(t)=1.51－1.93结果与双标准曲线法相近HealthyRNABBER2GAPDHΔC(t)28.4023.275.3128.4623.415.0528.43±0.0423.34±0.105.18±0.18CarcinomaRNABBER2GAPDHΔC(t)27.3622.814.5527.1222.864.2627.24±0.1722.83±0.034.41±0.21