实验1减数分裂

许文亮（博士教授）华中师范大学生命科学学院遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室E-mail:[e-mail]:027-67867814遗传学实验•WeiyuanYe葉威源[e-mail]290193712Room241,SchoolofLifeSciences•Ifyouhaveanyquestionsorcomments,pleasefeelfreetocontact.实验纪律•迟到×,早退×,旷课ו鼓励预习√,提出问题√•违规操作×，损坏设备ו掌握原理,独立操作,熟悉操作，讨论，实验记录报告完整,字迹工整√,互相抄袭ו创新，发现新问题，找到新方法，得到新结论√•保持实验室整洁√养成良好的实验习惯√考核形式及要求平时成绩(考勤,实验操作,实验记录,回答问题,提问,实验室整洁等)70%期末考试30%实验目录1、减数分裂（玉米花序）2、分离规律的验证（玉米花粉粒）3、植物染色体制备（蚕豆根尖）4、核型分析（蚕豆染色体）5、蚕豆根尖细胞微核检测技术6、果蝇遗传性状观察与培养7、果蝇唾腺染色体观察8、Arabidopsis叶片总RNA的提取及浓度测定9、RNA电泳检测10、总RNA中DNA的去除及纯化11、cDNA的合成及RT-PCR法研究基因的表达12、转基因烟草大实验(穿叉进行)(一)(二)(三)1）烟草无菌苗的获取；2）农杆菌感受态细胞的制备；3）含有GUSorGFP标记基因的重组质粒（PBI121-GUSorPZP221-GFP)转化农杆菌；4）共培养MS+6-BA1mg/L,2days;5）筛选培养MS+6-BA1mg/L+Cef(orcarbencilin500mg/L)+kanamycin50mg/L,photoperiod12-14h/D,3-4weeks;6）生根培养½MS+Cef300-500mg/L+kanamycin50mg/L，2-3weeks.7）检测（染色、荧光）13、遗传学实验综合比较分析实验一减数分裂一原理二目的1、了解动植物生殖细胞的形成过程；2、熟悉减数分裂各期特点；3、学习生殖细胞的取材和染色体制片减数分裂过程中有哪些重要的遗传学事件？三材料玉米雄花序（每年春季清明前后将玉米种子种下，六月中旬前后，选择玉米喇叭口以下部位手感柔软的植株，剥取雄花絮，投入卡诺固定液（乙醇/冰乙酸=3:1(v/v)），然后转入70%乙醇中，可保存2-3年）。注：2n=20，n=10；种植玉米应选择向阳的田地。减数分裂是一种特殊方式的细胞分裂，只发生在生殖细胞形成的过程中。减数分裂的特点是连续进行2次核分裂，而染色体只复制一次，从而形成4个只含单倍体数染色体的生殖细胞，经过受精后，合子中的染色体数目又恢复到2倍体水平，因此它是维持大多数动植物染色体数目世代稳定传递的根本机制。另一方面，基因的分离、自由组合以及交换无不是通过减数分裂发生的，所以深入认识减数分裂对学习遗传学规律是非常重要的。植物在花粉形成过程中，花药内的一些细胞分化成小孢子母细胞，即花粉母细胞（2n），每个花粉母细胞进行连续的2次细胞分裂，产生4个细胞，即具单倍体染色体数（n）小孢子或花粉。四步骤1、选择已固定的长约3.5-4.5mm的玉米雄花序（大中小各选1-2个），置清洁载波片上，用解剖针剥出花药（为淡绿色长囊状结构）将其转移至另一清洁载波片上。2、加1-2滴醋酸洋红（或改良苯酚品红）染色液于花药上，用解剖针将花药捣碎，在捣碎的过程中经常将载片置低倍镜（4*或10*）下观察直到较多的大细胞游离出来为止。3、将载片在酒精灯火焰上来回3-4次，稍加热（均匀使材料沸腾，烤干），继续染色5-10分钟。4、用镊子取出弃去的花药残渣，加清洁盖片，在盖片上覆一小块吸水纸，用拇指加压（加压时勿使盖片与载片滑动）5、镜检（先低倍再高倍）找出各期。五注意事项：总结本实验成功的关键？六作业：1）绘出你看到的减数分裂各期的图像；2）你发现的问题。玉米花粉母细胞减数分裂过程（自Willian等）显微镜下的细胞群中既有花粉母细胞,也有花药壁细胞。而且花药壁细胞中的绒毡层细胞也在进行有丝分裂。因此，在观察时要首先区分花粉母细胞和花药壁细胞。花粉母细胞呈圆形,个体较大；花药壁细胞是长方形，个体较小。一个花粉母细胞可相当于4～5个花药壁细胞的体积。另外，多核细胞是绒毡层细胞。染液的配制1.改良的苯酚品红原液A：称取3g碱性品红溶于100ml70%的乙醇中原液B：取10ml原液A溶于90ml5%的苯酚水溶液中染色液：55ml原液B加6ml冰醋酸和6ml37%的甲醛。取染色液2~10ml加90~98ml45%醋酸和1.8g山梨醇。此染液配制后为淡品红色，如果立即使用，染色较淡，放置2周后，染色能力显著增强，并且放置时间越久，染色效果越好。此染液在室温下存放，2年内染色性能保持稳定，无沉淀也不褪色。2.醋酸洋红将100ml45%醋酸加热煮沸，移去火源，然后缓慢加入1g洋红粉末，在此过程中要特别注意防止溅沸。待完全溶解后，重新置火上加热煮沸1~2min,此时用一细线悬一生锈的小铁钉浸入染色液中，约1min后取出，铁为媒染物，染色液中稍含微量铁离子可明显增强洋红的染色能力。配制完毕，在室温下静止约12h后过滤到一棕色试剂瓶中，储存备用。HistoryMeiosiswasdiscoveredanddescribedforthefirsttimeinseaurchineggsin1876,bynotedGermanbiologistOscarHertwig(1849-1922).Thesignificanceofmeiosisforreproductionandinheritance,however,wasdescribedonlyin1890byGermanbiologistAugustWeismann(1834-1914),whonotedthattwocelldivisionswerenecessarytotransformonediploidcellintofourhaploidcellsifthenumberofchromosomeshadtobemaintained.In1911theAmericangeneticistThomasHuntMorgan(1866-1945)observedcrossoverinDrosophilamelanogastermeiosisandprovidedthefirsttruegeneticinterpretationofmeiosis.减数分裂原理染色体在减数分裂中的行为Meiosis:配子形成过程中发生的一种细胞分裂，包括两次连续的核分裂，但染色体只复制一次，因而在形成的四个细胞核中，每个核只含有单倍数的染色体，即染色体减少一半。Importantconcepts同源染色体(homologouschromosome)：在二倍体生物中，每对染色体的两个成员中一个来自父方，一个来自母方。其形态大小相同的染色体称为同源染色体。不属于同一对染色体的染色体称为非同源染色体（nonhomologouschromosome)。联会(synapsis)：同源染色体的两个成员测向连接，像拉链一样地并排配对对称称为联会。始于偶线期，终止于双线期。联会复合体(synaptonemalcomplex,SC)：同源染色体联会过程中形成的一种独特的亚显微的非永久性的复合结构。由配对着的同源染色体的对立面各产生一个侧结构，叫侧体（lateralelements)，两个侧结构在中央并合成为一个中体（centralelements)。出现在偶线期，成熟于粗线期，消失于双线期。交换（Crossingover）：非姊妹染色单体间发生遗传物质的局部交换。交叉结（chiasma）：非姊妹染色单体间若干处相互交叉缠结，交叉是染色单体发生交换的结果。染色体在减数分裂中的行为前期I—中期I：染色体为2n。由于同源染色体的联会，使来自父母的每条具有2个染色单体的染色体配对。后期I—中期II：由于配对的同源染色体分开，进入子细胞中去的染色体数由2n变成n，但每个染色体仍保持2条染色单体；后期II—末期II：在后期II，每个着丝粒都一分为二，随后每个染色体的单体分开，进入每个子细胞中去的只有一条染色单体(n)。减数分裂I前期I细线期（leptotene）偶线期（Zygotene）粗线期（Pachytene）双线期（diplotene）中期I(metaphaseI)后期I(anaphaseI)末期I(telophaseI)减数分裂II前期II中期II—后期II末期II1．前期I（ProphaseI)（1）细线期，此期染色体呈细长线状，核仁依然存在（图2-3a）。在细线期和整个的前期中染色体持续地浓缩。细线期中，沿着每条染色体浓缩的小区域称为染色粒（chromomeres），呈链珠状。（2）偶线期细线状的染色体开始配对，在性母细胞中，实际上有两套染色体，每条染色体都有一条与之同源（homologous）的染色体，逐步相互配对或联会（synapsed），就像“拉链”式的两个成员称为同源染色体（homologs），在有丝分裂中是没有这一过程的。在有丝分裂中无论细胞中有几组（X）染色体，在减数分裂中只分成两套（N）（即两套基因组）。带两套染色体的细胞就称为二倍体（diploid）或“2n”表示，即是染色体的套数。只带有一套染色体的细胞就称为单倍体（haploid）。在大部分高等生物中如人类和显花植物的细胞都是2倍体。性母细胞经减数分裂所形成的配子只有一套染色体，是单倍体细胞。在偶线期一对同源染色体是怎样互相识别的呢？可能由于染色体末端的端粒（telomeres）是被锚定在核膜上，而同源染色体的端粒彼此相靠得很近，拉起“拉链”时可能从端粒处开始。“拉链”又是怎样拉的呢？两条同源染色体精确配对的机制是怎样的呢？虽然这个机制还未完全弄清，但我们已知需要一种由蛋白质和DNA所构成的精巧结构，称为联会复合体（synaptonemalcomplex，SC）（图2-4a、b；），联会时它总是夹在两条同源染色体之间。（3）粗线期在这一阶段，染色体完全联会，缩短变粗，但核仁仍然存在。在核中同源染色体的对数等于n。一对配对的同源染色体称二价体（bivalent）或四联体（tetrad），在特殊情况，存在不能配对的染色体则称单价体（univalent）或二联体（dyad）。染色粒的直线排列在每一对的同源染色体上，像一串精致的珠链。（4）双线期在细线期时每条同源染色体看起来都是单条的线状，其实此时DNA已在S期复制过了，只不过难以分辨出而已。显然到了双线期每条染色体就出现两条（图2-3d），与有丝分裂中期相似，其中每一条就称为染色单体（chromatids）。由于配对的同源染色体每条都产生两条姊妹染色单体，所以联会复合体的结构是含有一束四条染色单体，在双线期，同源配对时不太紧，其实是互相排斥呈现轻微的分离。非姊妹染色单体间的交错结构称为交叉（chiasmata或singular,chiasma），每一对同源染色体都有一个或多的交叉存在。发生在减数分裂早期的交叉称为交换（crossovers），可以在偶线期或粗线期。交换主要存在于减数分裂，在有丝分裂中十分罕见。一个交换是两个非姊妹染色单体之间的一次精确的断裂、互换（swapping）和重接。这样交换很显然帮助决定配对染色体的行为，每对同源染色体至少发生一次交换，这对于正常的分离是必要的。交换另外的作用是产生新的基因组合，这是群体遗传变异的一个重要来源。交叉的端化，非姊妹染色单体之间要彼此滑动，这样延缓了染色单体的分离。（5）终变期或称浓缩期此期明显不同于双线期期，染色体进一步地收缩，常可见到“O”形或“＋”形的一对同源染色体，这是端化的结果，染色体的收缩便于分裂时移动。2．中期I核膜、核仁消失，每对同源染色体位于赤道板上，着丝粒分居于赤道板的两侧，附着在纺锤丝上（图2-3f）