多聚赖氨酸修饰γ-Fe2O3纳米颗粒标记不影响神经母细胞瘤干细胞的活化和增殖

中国组织工程研究第20卷第10期2016–03–04出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchMarch4,2016Vol.20,No.10ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH1419·研究原著·仲智勇，男，1970年生，河北省唐山市人，汉族，1995年河北医科大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事小儿肿瘤方面的研究。中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)10-01419-07稿件接受：2016-01-24纳米颗粒标记不影响神经母细胞瘤干细胞的活化和增殖仲智勇，时保军，周辉，王文博(河北医科大学第二医院小儿外科，河北省石家庄市050017)引用本文：仲智勇，时保军，周辉，王文博.多聚赖氨酸修饰γ-Fe2O3纳米颗粒标记不影响神经母细胞瘤干细胞的活化和增殖[J].中国组织工程研究，2016，20(10):1419-1425.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.10.007ORCID:0000-0001-9950-0495(仲智勇)文章快速阅读：文题释义：纳米颗粒：纳米颗粒是一种人工制造的、大小不超过100nm的微型颗粒，可以为乳胶体、聚合物、陶瓷颗粒、金属颗粒和碳颗粒，纳米颗粒能够渗透到膜细胞中，并沿神经细胞突触、血管和淋巴血管传播，纳米颗粒有选择性地积累在不同的细胞和一定的细胞结构中，为药物的使用提供了有效性。巢蛋白：归为第Ⅳ类中间丝蛋白，分布在细胞浆内，参与细胞骨架的构成。巢蛋白表达起始于胚胎早期神经前体细胞，在胚胎脑中呈时空序列性表达，目前主要作为神经干细胞的标记蛋白，应用于神经干细胞的分离、鉴定和培养。Nestin在中枢神经损伤后能重新表达，可作为中枢神经系统损伤的早期、快速应答的敏感指标。摘要背景：维甲酸是最有潜力的神经母细胞瘤微小残留病灶的诱导剂，能诱导体内细胞分化，同时伴有肿瘤细胞增殖减低。目的：探讨纳米颗粒标记对神经母细胞瘤干细胞生物学特性的影响以及13-顺维甲酸对神经母细胞瘤干细胞的诱导分化作用。方法：采用无血清悬浮培养法体外分离培养神经母细胞瘤干细胞，多聚赖氨酸修饰γ-Fe2O3纳米颗粒标记神经母细胞瘤干细胞，在含有13-顺维甲酸的培养液中诱导分化培养，RT-PCR法检测标记前后和诱导前后Oct-4的表达变化，用细胞免疫荧光法观察标记前后和诱导前后nestin的表达变化。结果与结论：①20例患者的骨髓标本中有5例成功培养出神经母细胞瘤干细胞。②多聚赖氨酸修饰γ-Fe2O3纳米颗粒标记不影响神经母细胞瘤干细胞的活性和增殖能力，Oct-4mRNA表达和nestin表达也没有明显变化。③加入13-顺维甲酸培养后，细胞形态发生变化，生长速度减慢，Oct-4mRNA表达和nestin表达逐渐降低。④结果表明多聚赖氨酸修饰γ-Fe2O3纳米颗粒可以用于标记神经母细胞瘤干细胞，13-顺维甲酸可以诱导神经母细胞瘤干细胞分化。关键词：干细胞；肿瘤干细胞；神经母细胞瘤；γ-Fe2O3；纳米颗粒；13-顺维甲酸；肿瘤干细胞；细胞分化主题词：肿瘤干细胞；神经母细胞瘤；维甲酸；组织工程多聚赖氨酸修饰γ-Fe2O3纳米颗粒标记不影响神经母细胞瘤干细胞的活化和增殖多聚赖氨酸修饰γ-Fe2O3纳米颗粒标记Oct-4和Nestin的表达逐渐减低13-顺维甲酸诱导分化与未标记的神经母细胞瘤干细胞没有明显区别肿瘤干细胞已经出现分化Oct-4和Nestin的表达细胞活性神经母细胞瘤干细胞细胞增殖能力仲智勇，等.多聚赖氨酸修饰γ-Fe2O3纳米颗粒标记不影响神经母细胞瘤干细胞的活化和增殖P.O.Box10002,Shenyang110180基金资助：河北省2013年医学科学研究课题计划(20130151)Polylysine-modifiedgamma-Fe2O3nanoparticlelabelinghasnoeffectonneuroblastomastemcellactivationandproliferationZhongZhi-yong,ShiBao-jun,ZhouHui,WangWen-bo(DepartmentofPediatricSurgery,SecondAffiliatedHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,HebeiProvince,China)AbstractBACKGROUND:Retinoicacidisthemostpromisinginducerforneuroblastomaminimalresiduallesion,anditcaninducecelldifferentiationinvivo,accompaniedbyreducingtumorcellproliferation.OBJECTIVE:Tostudytheeffectofnanoparticlelabelingonbiologicalcharacteristicsofneuroblastomastemcells,andtheroleof13-cisretinoicacidtoinducedifferentiationofneuroblastomastemcells.METHODS:Neuroblastomastemcellswereisolatedandculturedinvitrousingserum-freesuspensionculturemethod,labeledwithpolylysine-modifiedγ-Fe2O3nanoparticlesandinducedinculturemediumcontaining13-cisretinoicacid.RT-PCRwasusedtodetecttheexpressionofOct-4beforeandafterlabelingaswellasbeforeandafterinduction.Immunofluorescencemethodwasusedtodetecttheexpressionofnestinbeforeandafterlabelingaswellasbeforeandafterinduction.RESULTSANDCONCLUSION:Neuroblastomastemcellsweresuccessfullyculturedinthebonemarrowsamplesfrom5of20cases.Polylysine-modifiedγ-Fe2O3nanoparticlelabelingdidnoinfluencetheviabilityandproliferationabilityofneuroblastomastemcells,andalsohadnoeffectonOct-4mRNAandnestinexpression.Afterculturedintheculturemediumcontaining13-cisretinoicacid,thecellshapechangedandthegrowthratesloweddown.Moreover,theexpressionofOct-4mRNAandnestinwasgraduallyreduced.Thesefindingsindicatethatpolylysine-modifiedgamma-Fe2O3nanoparticlescanbeusedtolabelneuroblastomastemcells,and13-cisretinoicacidcaninducethedifferentiationofneuroblastomastemcells.Subjectheadings:NeoplasticStemCells;Neuroblastoma;Tretinoin;TissueEngineeringFunding:theMedicalScienceResearchProjectofHebeiProvincein2013,No.20130151Citethisarticle:ZhongZY,ShiBJ,ZhouH,WangWB.Polylysine-modifiedgamma-Fe2O3nanoparticlelabelinghasnoeffectonneuroblastomastemcellactivationandproliferation.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(10):1419-1425.0引言Introduction神经母细胞瘤起源于交感神经系统，主要通过血液和淋巴转移，属于神经内分泌肿瘤。神经母细胞瘤的临床表现多种多样，且发展快，恶性程度高，早期就容易发生转移，大多发现时已处于晚期，一般预后比较差，存活率低。治疗手段主要以手术以及放化疗为主，但总体效果欠佳，不良反应比较大，并且容易复发。肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中的一群细胞，具有与干细胞相似的增殖和分化特性，与肿瘤的发生和演变有关，肿瘤的复发转移以及耐药均与肿瘤干细胞有关。神经母细胞瘤细胞在体外培养形成的细胞球具有干细胞的特性，因此考虑神经母细胞瘤的复发可能与神经母细胞瘤干细胞有关。如何对神经母细胞瘤干细胞进行标记以及诱导其分化是神经母细胞瘤干细胞的研究内容之一。纳米颗粒具有比较好的生物相容性，可以非侵袭性标记细胞，并追踪被标记细胞的增殖分化以及在疾病发展和治疗中的作用。维甲酸是神经母细胞瘤细胞的诱导剂，能够诱导细胞分化和凋亡，并可以抑制肿瘤细胞的增殖。实验对神经母细胞瘤干细胞进行体外分离培养，用多聚赖氨酸修饰γ-Fe2O3纳米颗粒标记细胞，观察其对神经母细胞瘤干细胞生物学特性的影响，并探讨13-顺维甲酸对神经母细胞瘤干细胞的诱导分化作用。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计细胞学体外观察实验。1.2时间及地点于2014年1至11月在河北医科大学实验室完成。1.3材料1.3.1骨髓液收集20例伴有骨髓转移的Ⅳ期神经母细胞瘤患者的骨髓液，年龄30-60岁，骨髓涂片发现有成团的肿瘤细胞，流式分析仪鉴定CD81+CD56+CD45-细胞为神经母细胞瘤细胞。1.3.2主要试剂DMEM/F12培养液、胰蛋白酶仲智勇，等.多聚赖氨酸修饰γ-Fe2O3纳米颗粒标记不影响神经母细胞瘤干细胞的活化和增殖ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH1421(Gibco)；胎牛血清(Biochrom)；牛血清白蛋白(上海鼎国公司)；13-顺维甲酸、二甲基亚砜、多聚赖氨酸(Sigma)；青链霉素双抗溶液(沈阳东药集团公司)；人表皮生长因子、人碱性成纤维生长因子(Invitrogen)；D-Hank's液(上海钮森公司)；小鼠抗人nestin单克隆抗体(Abcam)；Cy3标记羊抗鼠IgG二抗(JacksonImmunoresearchLaboratories)；PBS(北京中山生物技术公司)；谷氨酰胺(美国Hyclone公司)。1.3.3主要仪器恒温CO2培养箱(BIO-RAD公司)；倒置荧光显微镜(Nikon)；细胞计数器(上海添华达公司)；-80℃超低温冰箱(中科美菱低温科技有限责任公司)、10mL移液管、流式细胞仪、酶联免疫检测仪(Bio