多肽介导的核酸药物递送系统研究进展

多肽介导的核酸药物递送系统研究进展丁晓然，王升启*(军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京??100850)[摘要]核酸药物作为新型基因治疗药物备受关注，但生物学稳定性差、易被体内核酸酶降解、生物利用度低、靶组织内聚集浓度低等是制约其发展的主要因素。新的药物递送技术的快速发展在一定程度上解决了核酸药物的稳定性及靶向递送问题，极大地推动了核酸药物的研发进展。尤其是多肽蛋白类递送载体，已成为核酸药物递送系统研究领域的热点之一。介绍核酸药物递送载体多肽修饰的两种主要方式--共价缀合和非共价络合，重点综述近年来多肽缀合物和复合物以及多肽修饰的载体在核酸药物递送系统中的应用研究，探讨多肽介导的核酸药物递送系统在应用中存在的问题，为新型核酸药物递送系统研发提供参考。[关键词]多肽载体;核酸药物;药物递送系统核酸药物(nucleicaciddrug)是目前国际上重点关注的一类新型生物技术药物，具有设计方便、特异性强、不易产生耐药、利于快速反应等特点，可用于治疗病毒感染性疾病、心血管系统疾病、代谢类疾病以及肿瘤等多种疾病[1]。自1998年第1个核酸类药物VitraveneTM被美国FDA批准上市后，多个核酸药物相继进入临床试验[2-3]。然而，核酸药物存在生物学稳定性差、易被体内核酸酶降解、生物利用度低、靶组织内聚集浓度低等缺点，其临床应用进展缓慢。近年来，天然核酸药物的化学修饰(如硫代修饰、混合骨架核酸等)、新型核酸类似物(如肽核酸)等可提高核酸药物稳定性的新技术以及核酸药物靶向递送技术的快速发展，极大地推动了核酸药物的研发进展。2013年1月29日，在时隔15年之后，第3个也是首个全身给药的核酸药物KynamroTM被美国FDA批准上市，掀起了新一轮核酸药物研究热潮。利用载体技术和给药体系提高核酸药物生物学活性，改善其体内分布，增强其对细胞的靶向性以及被细胞摄取能力，提高靶组织中药物的浓度和生物利用度，是核酸药物研发的重点和趋势所在。目前最为常见的核酸药物递送载体主要有以下几类:脂质体(如普通阳离子脂质双层、脂质体DOTAP、Lipofectine、pH敏感脂质体等)、阳离子多聚复合物[如聚乙烯亚胺(PEI)、聚酰胺-胺(PAMAM)等]、树枝状高聚物(DEN)和各类多聚物的微粒体(如聚氰基丙烯酸酯纳米粒、聚乳酸纳米粒等)、基于特异性受体的配体介导的核酸分子靶向递送系统和多肽蛋白类递送载体以及利用唾液酸蛋白、多糖、表皮生长因子、叶酸、转铁蛋白、甾体激素、单克隆抗体等靶向分子修饰而具有主动靶向作用的纳米粒[4-5]。随着新载体技术和给药体系的不断发展，一些核酸药物研发公司相继构建了各具特色的递送技术平台，其中具有代表性的核酸药物递送系统包括ArrowheadResearch公司的动态多价偶联递送系统(dynamicpolyconjugates，DPC)[6]和转铁蛋白靶向的环糊精纳米粒递送系统(RONDELTM)[7]、[8]、Silence公司基于脂质的siRNA递送系统(AtuPLEXTM)Tekmira公司的脂质纳米粒(LNP)技术[9]以及AlnylamPharmaceuticals公司的GalNAc-siRNA(N-乙酰半乳糖胺与siRNA的结合体)肝靶向递送系统[10]等。基于上述递送系统，已有多个核酸药物相继进入临床研究阶段(见表1)，并有多个相关药物处于申报临床研究或临床前研究的不同阶段。表1基于新型递送系统的临床在研核酸药物Table1Nucleicaciddrugsbasedonthenewdeliverysysteminclinicaldevelopment开发公司AlnylamPharmaceuticalsSilenceTherapeuticsArrowheadResearch药物ALN-TTRscAtu027ARC-520CALAA-01载体GalNAc-siRNAAtuPLEX??DPCRONDEL??靶标甲状腺素运载蛋白(TTR)蛋白激酶N3(PKN3)乙型肝炎病毒(HBV)核苷酸还原酶亚单位M2(RRM2)埃博拉病毒L聚合酶、病毒蛋白24(VP24)和病毒蛋白35(VP35)适应证TTR介导的淀粉样变性(ATTR)胰腺癌慢性乙型肝炎感染淋巴瘤开发阶段临床Ⅱ期临床Ⅰb/Ⅱa期临床Ⅱ期临床Ⅰb期TekmiraTKM-EbolaLNP埃博拉病毒感染临床Ⅰ期在众多靶向递送技术当中，多肽蛋白类递送载体是目前研究的热点之一。其中较为简单的一种递送系统是以阳离子肽即细胞穿膜肽(cell-penetratingpeptides，CPP)或蛋白转导域(proteintransductiondomains，PTD)为递送载体，而CPP不仅可用来提高核酸药物的细胞摄取率，还能靶向特定细胞表面受体或组织。自1994年第1条CPP被Fawell等发现以来，一系列新的CPP相继被报道。目前，尽管多肽介导的核酸药物转运机制尚未完全阐明，但该递送载体发展迅速，已经成为核酸药物研发的重点领域[11-12]。合成法完成，通常反应效率较高。连接多肽与寡核苷酸分子的连接臂需要具有一定的化学稳定性，从而使肽-寡核苷酸缀合物在进入体内和随后的转运过程中保持稳定，而在靶细胞中连接臂可被特定蛋白水解酶降解，从而释放核酸药物。例如，二硫键已被证明可用于多肽介导的核酸药物递送系统[14]。研究发现，二硫键在缀合物到达内涵体或细胞质后才会断裂，这种断裂使多肽不会在细胞内影响寡核苷酸分子对其靶标的抑制作用。但最近的体内实验结果表明，这种断裂不是必须的。二硫键以及巯基可能会增加核酸药物的胞内摄取率，其作用机制尚不清楚[15-16]。共价缀合的优点在于可以得到结构明确、单一的化合物，简化了药物研发过程。但这种修饰方法也存在一定的局限性，如强阳离子多肽与带负电荷的寡核苷酸缀合和纯化存在一定的难度，限制了用于缀合的多肽类型;此外，共价键修饰可能会影响带电荷核酸分子的生物活性。因此，这种策略更适用于中性的磷酸二酰胺吗啉代寡核苷酸(phosphorodiamidatemorpholinooligomers，PMO)(Summerton等,AntisenseNucleicAcidDrugDev,1997年)和肽核酸(peptidenucleicacids，PNA)的修饰(Nielsen,MethodsEnzymol,1996年)。1核酸药物递送载体的多肽修饰策略核酸药物递送载体的多肽修饰主要采用共价缀合和非共价络合两种方式。1.1共价缀合共价缀合是通过二硫键、硫醚键、硫醇马来酰亚胺、磷酸二酯键等共价键而将多肽共价缀合到寡核苷酸分子或其他载体上[13]，这种缀合可经固相合成法或液相非共价络合是通过非共价键将多肽及其衍生物与带负电荷的寡核苷酸分子络合，形成复合物。一些肽载体含有疏水性基团(如疏水性氨基酸及脂肪酸、胆固醇等)，这些疏水性基团可与中性及带负电荷的分子络合形成复合物，这种络合形成的复合物能够更好地携带寡核苷酸分子透过质膜，将其高效地递送至靶部位[17]。非共价键连接时，不需要对寡核苷酸进行末端修饰，仅通过简单的混合即可形成复合物，同时这种方法还能有效防止核酸酶对寡核苷酸的降解，因此该方法应用更为广泛。近年来，随着递送技术的不断发展，还有多种修饰策略相继被提出。如Futaki等采用新一代非共价结合化学修饰多肽载体技术，将十八烷酰基化的阳离子多聚精氨酸肽用作质粒DNA的转运载体获得成功[18]。而且，一些肽相关纳米载体、阳离子聚合物以及多肽复合体/脂质体等也被用于寡核苷酸递送研究。团队将可特异性结合整合素αvβ3受体的环肽cRGD与靶向血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)的siRNA分子进行共价缀合后发现，cRGD-VEGFR2siRNA可特异性进入整合素αvβ3受体阳性的新生血管内皮细胞--人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)，并抑制VEGFR2表达;cRGD-VEGFR2siRNA显微注射入斑马鱼体内后，能够抑制斑马鱼新生血管的形成;在小鼠体内实验中，cRGD-VEGFR2siRNA不会诱导先天的免疫反应，且可特异性靶向肿瘤组织，具有显著的抗肿瘤作用[21]。1.2非共价络合CPP与PMO的缀合物PPMO近年来被广泛应用于抗病毒、抗细菌以及治疗遗传性疾病等领域。PMO最早由AVI生物制药公司(现更名为SareptaTherapeutics公司)开发[22]，具有诸多优点，如不被酶降解、在细胞内稳定性强、对细胞无毒副作用、且不会激活细胞分泌干扰素及免疫应答等。但是，由于PMO的分子结构中不带有任何电荷，使其无法被细胞表面受体识别，也无法通过转染方式导入细胞内，极大地阻碍了其实际应用。而PPMO技术的发展则有力地推进了PMO的应用研究，研究人员利用该递送技术确证了PMO在多种病毒感染性疾病中均具有较好的抗病毒作用，如卡波济肉瘤相关疱疹病毒、单纯疱疹病毒、日本脑炎病毒、麻疹病毒、登革热病毒、柯萨奇病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、西尼罗河病毒以及冠状病毒等[23]。另外，有研究表明，相应的多肽-PMO缀合物可干扰血凝素激活蛋白酶TMPRSS2pre-mRNA的剪接，有效降低甲型流感病毒的滴度[24]。在人呼吸道合胞病毒感染的细胞和小鼠模型中，相应的多肽-PMO缀合物均可有效阻断病毒复制;且在感染早期给药，可显著降低小鼠肺组织的病毒滴度[25]。另有研究表明，对于感染猪生殖和呼吸综合征病毒的猪，无论是感染前还是感染后给予相应的多肽-PMO缀合物治疗均可有效降低病毒血症和间质性肺炎的发生[26]。在抗细菌感染方面，Sarepta公司与其合作者近期研究发现，靶向金葡菌促旋酶AmRNA的PPMO在动物体内显示出良好的抗菌作用，其可特异性结合靶基因，抑制细菌蛋白质表达，还可避免传统抗生素的耐药问题。目前，该公司的这一抗菌新药正处于临床前研发阶段。2多肽缀合物和复合物在核酸药物递送系统中的应用20世纪90年代Bongartz等(NucleicAcidsRes,1994年)首次报道了多肽介导的反义核酸在细胞内的递送过程，即将CPP通过与反义核酸共价连接形成缀合物，介导核酸进入细胞。这一方法随后被广泛用于PNA、PMO、不同修饰的反义核酸以及siRNA等核酸药物的修饰。Pooga及其研究团队在体内外实验中发现，CPP与靶向甘丙肽受体Ⅰ型mRNA的PNA共价缀合后，可有效地提高PNA在人黑色素瘤细胞中的摄取率;多肽共价修饰可提高PNA对体内甘丙肽受体的抑制作用(Pooga等,NatBiotechnol,1998年)。另有研究人员将F-3肽与经不同化学修饰的反义核酸共价缀合后发现，这种共价缀合可显著提高核酸药物在体内对转录因子ld1的抑制作用[19]。Meng等[20]经实验研究发现，将Tat(47-57)肽与siRNA缀合后，可有效介导siRNA进入细胞。南方医科大学的季爱民教授及其研究段。PPMO抗菌剂的开发将为细菌感染性疾病提供新的治疗策略[27]。另外，Sarepta公司一直致力于遗传性疾病--杜氏肌肉萎缩症(Duchennemusculardystrophy,DMD)治疗药物的开发，PPMO技术也被证实可提高PMO对DMD的治疗效果[28-29]。尽管PMO的安全性已经得到证实，但是PPMO技术引入缀合肽链后，其安全性有待进一步评价。清蛋白非特异性结合以及毒性等问题，只能用于寡核苷酸分子的体外转染，并不适用于体内递送，如lipofectin或lipofectamine等。采用亲水聚合物(如PEG等)对脂质体表面进行功能化修饰，则能将其改造为核酸分子的体内递送载体[38]。但PEG修饰后的脂质体载体与细胞膜的相互作用减弱，降低了核酸分子的细胞摄取率，且修饰后的载体还不利于核酸分子的胞内释放[39]。为了提高脂质体载体的核酸递送效率，研究人员在新的脂质体载体中引入了多肽分子。当富含精氨酸的CPP结合到脂质体载体表面后，可显著提高载体的递送效率[38]，且安全性可控[40]。另一组研究人员将阳离子脂质体用含16个赖氨酸残基和靶向肽Y的嵌合肽进行修饰后，成功用于递送靶向荧光素酶