大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备

3.大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，同时，DNA在电场力的作用下进入细胞，随后细胞复苏和弥合，从而实现质粒DNA的物理转移。为避免电击时出现“击穿”，即产生电流，细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。转化效率为109～1010转化子/µgDNA。3.1．感受态细胞的制备（1）感受态细胞及材料准备同钙转化感受态细胞的制备相同。（2）选合适的大肠杆菌在4℃，3000rpm下离心10min，弃上清液（如需要，沉淀可在4℃的10%甘油中保存1～2天）。（3）弃上清，离心管中加入少量ddH2O，轻柔的悬浮沉淀后，再将水注满离心杯，4℃，3000rpm离心10min。（4）重复步骤（3）1次。（5）小心弃上清（沉淀可能会很松散），再往离心管中加入少量10%甘油（灭菌，预冷），重悬菌体，再加满10%甘油，4℃，4000rpm离心10min。（6）用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2～3ml，将细胞按200μl等份装入微量离心管，放置于－80℃下保存。（7）按照钙转化感受态细胞方法进行转化效率和抗性检测。3.2．电转化为了降低离子浓度，待转化的质粒DNA，如质粒或酶连产物，在电转化前应该进行纯化（乙醇沉淀），以下所有步骤都需要保持无菌操作。（1）从－80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；加入待转化的质粒DNA，冰浴10min；同时将电转化杯进行冰浴。实际操作中，如果电转化杯浸泡在乙醇中，可提前取出电转化杯，在无菌的超净台上吹干。（2）打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。特别注意，不同的电转化杯，所使用的电压不同。防止电压不够，难以有效转化，以及，电压过高，击爆电转化杯，产生火花，产生危险。（3）将冰浴后的感受态细胞（含DNA）转移到电转化杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部（注意：其体积以填充电转化杯到电极之间空间即可，具体的用量可参见具体所使用的电转化杯的说明）。（4）将电极杯推入电转化仪中，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入800μl的LB液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。（5）37℃，220～250rpm复苏40min。（6）按照钙转步骤进行涂板培养。【电击杯清洗流程】（1）用清水将电击杯稍冲一下。（2）向电击杯中加入75%酒精浸泡2h。（3）去酒精，再用蒸馏水冲洗2～3遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。（4）加入无水乙醇2ml于电击杯中，浸泡30min。（5）去无水乙醇，于通风厨内挥发干乙醇。（6）将清洗好的电击杯放入－20℃冰箱内待用。【注意】不同样品使用的电转化杯应分开；若长期不用，应将清洗好的电转化杯浸泡在乙醇中。