大豆转基因

湖南农业大学硕士学位论文菜用大豆的再生与转化体系优化钟灿二0一二年四月附件5独创性声明与关于论文使用授权的说明独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日第一章引言1毛豆概况1.1毛豆的产销现状毛豆，又叫菜用大豆、青毛豆，在日本又叫枝豆或者啤酒豆，豆科大豆属，鲜粒和干豆粒均可以作菜用[1]。毛豆是鲜食未完全成熟黄豆的果实，即在豆荚鼓粒饱满，荚色、籽粒呈翠绿色时采青剥仁作为菜用的大豆，是大豆的专用型品种，同时也是深受广大消费者喜爱的高蛋白蔬菜之一[2]。中国是大豆的原产地之一，最早将大豆驯化并进行种植，至今有4000多年的栽培历史，我国虽然种植大豆历史悠久，但是对大豆生产的推广研究工作开展较晚，相反在第一次世界大战欧美国家大面积种植大豆，1930年美国和加拿大通过杂交选育对大豆进行品种的改良，从而推动世界性的大豆大生产。中国是继美国、巴西、阿根廷的第四大产大豆的大国，而毛豆是中国的特产之一，在中国各大产区均有栽培，以长江中下游地区和东南沿海一带为多，其中台湾是中国毛豆的生产大省之一，其次在泰国、韩国、日本等东南亚国家也有生产。毛豆的消费市场也主要分布在亚洲国家，尤其是日本及中国东南沿海省、自治区。日本已发展成为世界上菜用大豆消费量最大的国家，每年的消费量在16万t以上，约40%要从国外进口[3]。毛豆营养品质和食用品质很好，且是世界公认的天然无公害蔬菜，近年来欧美市场对其需求量逐渐增多，特别是速冻毛豆在国际市场上销售量大增。1.2毛豆的品质毛豆的品质包括外观品质、营养品质和食用品质这三个方面。毛豆的外观品质只要是指其荚色、荚的大小、每荚粒数以及豆粒大小。国际上通常认为荚色翠绿、每荚至少有两粒发育良好的种子，且两粒种子必须相邻、荚长至少达到4.5cm、宽达到1.3cm、厚达0.6cm,鲜荚每公斤不超过340个荚，干籽粒百粒重在30g以上，并要求豆荚含菌量少于3百万单位/g，且不应含有大肠杆菌和沙门氏菌[4]。20世纪90年代，专家一致认为毛豆的食用品质应该从甜度、质地、香味和鲜味等方面综合评价，一般以甜度高的菜用大豆的口感好，其中蔗糖的含量是影响菜用大豆甜度的主要因素。籽粒中游离氨基酸的含量是继蔗糖之外影响菜用大豆口感的第二大因子。在菜用大豆籽粒的氨基酸中，谷氨酸的含量最高，而在游离氨基酸中浓度最高的是天冬门酰氨，其次是丙氨酸，谷氨酸位于第三[5]。毛豆的营养品质，毛豆籽粒粗蛋白的平均含量是39.93%[6]，毛豆籽粒中含有丰富的禾谷类作物所缺乏的赖氨酸，氨基酸的组成较均衡[7]。对毛豆籽粒含油量的测定结果表明，菜用大豆籽粒的平均含油量为18.44%，其中含有11.07%的棕榈酸，3.22%的硬酯酸，20.64%的油酸，53.34%的亚油酸和9.19%的亚麻酸，其不饱和脂肪酸的含量高达84.43%，是一种高品质油。菜用大豆还含有Ca、Fe、Mg等多种矿务质和维生素，包括粒用大豆所缺乏的维生素C(27mg/100g)和膳食纤维[8]。1.3毛豆中的活性成分大豆中除了含有丰富的蛋白质、氨基酸和油脂等营养成分，还有许多生理活性成分，比如大豆皂苷、大豆异黄酮、大豆低聚糖、大豆多肽等。《神农本草经》首次将大豆作为药物，并记载其药用价值，并列为“中品”。《本草纲目》记载，大豆有逐水肿、长肌肉、填骨髓、涂痈肿的作用，“久服容颜、乌发、防衰老”。虽然大豆的活性成分较多，且对人类的生活和健康都有很大帮助。大豆皂苷就又抗肿瘤，降血糖，降血脂，调节免疫等功能，但是有一定毒性[9]。但是大豆异黄酮经过学者的多次均认为其安全无害，且其主要存在于豆类植物中，且是天然的植物雌性激素，在动物体内不能合成，近年来更是发现它对预防乳腺癌的功效较好，而收到国内外学者的关注。1.3.1大豆异黄酮的功能大豆异黄酮是只有在豆科植物中微量存在的多酚化合物，大豆中的异黄酮的含量为0.1%~0.3%[10]，是一类具有广泛营养学价值和健康保护作用的非固醇类物质[11]，它主要包括染料木素、大豆苷元和黄豆黄素。大豆异黄酮带有2个或3个羟基和芳香环，此结构相对稳定，易于通过细胞膜，并利于和受体蛋白以及酶结合。与雌激素相似的结构特点使异黄酮能够与雌激素受体（ER）结合，从而表现出雌激素活性和抗雌激素活性。大豆异黄酮的其他生物学活性还包括抗氧化活性、抑制细胞增殖和分化、抗血管生成、促进性激素结合球蛋白（SHBG）合成等。但总的来说异黄酮的生理作用主要是由其生物活性（尤其是雌激素活性和抗雌激素活性）决定的[12]。大豆异黄酮有抗癌症的作用，其对乳腺癌、胃癌、肝癌、白血病及其它一些癌细胞系的生长、增殖具有抑制作用[13]。学者通过大量的癌细胞体外培养和小白鼠动物实验证明了大豆异黄酮的抗癌作用。Matsukawa[14]等证实大豆异黄酮抑制人胃癌细胞HGC-27的增殖，使细胞停滞在G2/M期，其半数量大抑制效应浓度(IC50)为20umol/L。大豆异黄酮抑制人乳腺癌可能的重要分子机制为诱导肿瘤生长因子TGF-β和TGF-β受体表达的增加，从而抑制人乳腺癌细胞BcBp-37的增殖，同时当大豆异黄酮的浓度10umol/人时，能抑制人乳腺癌细胞MCFT的增殖[15]。Honma[16]等研究表明大豆异黄酮不仅抑制人髓性白血病细胞K562的生长(IC50为9.3umol/L)，且能诱导K562向红细胞系分化。Barnes[17]等实验发现用含分离大豆蛋白饲料喂养的大鼠，乳腺癌的发生数目显著低于不含大豆组，大豆异黄酮有减少肿瘤数量，延长潜伏期等作用。Sharma[18]等研究显示富含大豆的食品可抑制乙烯雌酚诱导的幼鼠前列腺的发育异常，明显延长前列腺自发性肿瘤的潜伏期，且减少列腺癌的发生率。对结肠癌大鼠喂养含大豆异黄酮饲料，结果表明能明显抑制大肠癌的癌前病变发展，即减少畸变隐窝的发生数。此外，大豆异黄酮还能抑制人淋巴白血病细胞MOLT-4、神经母细胞、横纹肌肉瘤细胞、尤文氏肉瘤细胞等肿瘤细胞的生长。大豆异黄酮有雌性激素和抗雌性激素的作用，在低激素水平的实验对象体内，会与雌性激素受体结合显示雌性激素作用，从而对由雌性激素衰退引起的疾病：如血脂升高、动脉硬化、更年期潮热、绝经后骨质疏松等有良好的预防和治疗效果，而在高激素水平的实验对象体内，显示抗雌性激素的作用[19]。诸多学者还研究发现大豆异黄酮有降低血脂、延缓衰老、抗氧化特性、预防心血管病、抗炎作用和预防老年痴呆等作用。Stintzing研究发现大豆异黄酮的活性成分主要有游离苷元金雀异黄素(genistein,Gen)(又称染料木黄酮)、黄豆苷元(daidzein,Den)和大豆黄素(glycitein,Gly)以及其衍生物共9种化合物，而真正在体内被吸收而产生生理活性的主要成分是Gen和Den[20]。1.3.2大豆异黄酮的代谢大豆异黄酮合成代谢途径由苯丙烷途径和异黄酮合成途径共同组成，主要存在于豆科植物[21]。主要包括以下几个关键酶：苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸羟化酶(C4H)、4-香豆酸-辅酶A连接酶(4-CL)、查耳酮合成酶(CHS)、查耳酮异构酶(CHI)和异黄酮合成酶(IFS)[22]。其中苯丙烷类代谢途径(phenylpropanoidpathway)是植物次生代谢过程红重要途径之一，它是木质素、花青素、芪类和黄酮类化合物等次生代谢物的共同代谢物中间体，对于植物抗性、植物品质以及人类的健康有重要的作用[23]。2.毛豆高效再生研究进展豆类是重要的植物蛋白质来源的以及世界上主要的粮食和油料作物，但是由于愈伤组织难以分化、原生质体再生困难等因素，20世纪80年代以前，学者利用各种不同的大豆外植体进行豆类再生，其再生植株的发生频率和重演性都很低。直到1980年Cheng[24]等在含有10～50μmol/LBA的改良B5培养基上，利用无菌苗的子叶节外植体，诱导丛生芽获得了高频率的再生植株，为豆类的再生体系的建立翻开新的篇章，之后学者在此基础上通过改良培养基和利用其他不同外植体获得了较多的大豆再生植株。获得高频率的再生植株是大豆遗传转化基础，笔者从豆类的消毒、外植体选择以及培养基的配方几个关键步骤着手，综述了近年来应用较广，可以获得较好外植体的方法。2.1豆类成熟种子的消毒方法要培养出较好的豆类再生植株，首先要获得无菌苗，这就涉及到成熟大豆消毒灭菌的操作步骤。20世纪学者常用的豆类成熟种子消毒的方法的主要是70%乙醇+0.1%HgCl2；70%乙醇+6%NaOCl；或者70%乙醇+6%NaOCl+0.1%HgCl2[25]。2002年，刘海坤和卫志明[26]发明了一种可以提高豆类成熟种子消毒效率，且能使其萌发速度更快，萌发效率更好的氯气消毒法。具体操作是取表面洁净的豆类种子，放入含有30%NaOCl+20%盐酸反应生成的氯气的密闭容器中，一定时间后取出接到培养基中。首先他们取不同的豆类品种进行实验，发现氯气消毒法适宜大多数基因型的种子，平均污染率为0.9%，平均萌发率高达95.9%。然后他们对氯气消毒时间进行实验，发现消毒时间从45min到24h消毒效果差异不大，最佳消毒时间为2~6h。最后他们用这种方法与上述三种方法相比较实验，发现氯气消毒能降低污染率，萌发率高达98.7%，而上述三种消毒方法萌发率最高的也只有85.3%。同时氯气消毒法能显著提高豆类萌发速度，接种后28小时就能达到80%的萌发率，而其它消毒方法的的萌发高峰期出现在接种后的50小时。笔者认为氯气消毒方法优点很多，但是其对环境和人体健康有一定影响，需要一个专用的密封的消毒空间。2.2豆类再生体系起始外植体的选择目前可用于豆类再生的起始外植体主要有幼胚、幼胚子叶、胚轴、成熟胚子叶、子叶节、初生叶和初生叶节等。程林梅等[27]1998年采用不同豆类品种的下胚轴、上胚轴、小真叶和幼胚作外植体进行植株再生的研究。结果表明在其供试品种中，汾豆33号诱导植株再生率最高；诱导频率依次为下胚轴上胚轴小真叶幼胚；下胚轴在B5+NAA0.3mg/L+KT1mg/L培养基上可诱导出愈伤组织并直接分化成苗，植株再生频率为34%，最高达50%。而1999年王升吉[28]等利用不同豆类品种的顶芽、胚轴、子叶节、子叶、叶片等做为外植体，进行组织培养再生研究。结果表明：在供试品种中，辽豆11号和辽豆10号的再生能力较强，诱芽率分别为39.8%和36.0%。对诱芽率的影响，经L16(4)5正交实验结果为外植体品种培养基，外植体对诱芽率影响依次为：子叶节顶芽子叶下胚轴。张东旭[29]等用胚尖再生体系与子叶节再生体系比较研究发现以胚尖为外植体的豆类再生体系具有再生率高、操作简便、周期短、重复性好等优点。对于上述两种结果，笔者认为是试验品种和培养基差异等造成结果有些出入，但是近年来大多数学者培育豆类再生植株时利用子叶节和下胚轴的成功率较高，笔者经过试验，结果表明子叶节和下胚轴是获得豆类再生植株较好的外植体。2.3豆类再生体系基本培养基的选择近年来，培养基与豆类再生体系建立的关系以及激素对丛芽诱导和再生体系影响的研究较多。林树柱[30]等以“合丰35”豆类品种的成熟种子为材料，研究不同浓度6-BA对诱导子叶节和茎尖出芽的影响，其中子叶节和茎尖的萌发基本培养基分别为B5培养基和1/2MS盐+B5培养基，不定芽诱导基本培养基为B5培养基，生根基