大鼠心脏移植模型制作

大鼠心脏移植模型制作大鼠心脏移植模型是研究移植排斥反应、器官保存和药物筛选的常用动物模型。由于此模型操作简单、能直接观察到移植物的状况，通过观测移植心是否搏动和/或心电图可以鉴别移植物的存活情况，耐受和排斥、成功和失败的标准明确。因而应用十分广泛。自20世纪60年代Abboll等创立心脏移植模型依赖，经过多次修改，目前受鼠操作、存活率均较以前有很大的提高。一、手术器械：显微外科手术器械包，手术显微镜1台，自制S拉钩（用橡皮筋一端带弯成S形大头针）4个，眼科剪1把，其它外科器械若干及纱布、棉球、棉片和橡皮条等。二、供、受者大鼠的选择根据不同的研究目的选择不同的动物品系，在同种移植模型中，一般采用两种纯系健康大鼠，如Lewis大鼠，BrownNorway大鼠（BN），DA大鼠等，国内应用Wistar，SD大鼠也比较多。如果是异种移植可以选用豚鼠－大鼠，仓鼠－大鼠，小鼠－大鼠等不同品系的动物。三、麻醉麻醉采用戊巴比妥钠50mg/kg体重腹腔麻醉的方法，可以以采用5%水合氯醛3ml/kg体重，麻醉过浅时加乙醚吸入辅助、四、供心切取手术大鼠麻醉后仰卧位固定，用酒精消毒胸腹部，正中切口1次剪开胸腹部皮肤，暴露胸部，沿腹白线开腹，暴露腹主动脉和下腔静脉，并从下腔静脉缓慢注入2ml含肝素的无菌生理盐水（25IU/L）全身肝素化，然后横断腹主动脉和下腔静脉放血，迅速打开胸腔，0℃～4℃预冷的平衡液不断淋浇心脏表面，并向胸腔加入少量冰屑，分别在靠近右心房处结扎并切断下腔静脉和右上腔静脉，结扎右上腔动脉时将右心耳一起结扎。游离升主动脉、肺动脉和无名动脉，实施腹部心脏移植模型则在无名动脉分叉处剪断，如果是颈部心脏移植模型，于主动脉分出无名动脉的远端结扎切断主动脉，于靠近主动脉约1mm处切断无名动脉，再在左右肺动脉分叉处剪断肺动脉，提起心脏，1次结扎左上腔、左肺和右肺静脉以及周围组织，并在远心端剪断，取下供心，放入0℃～4℃平衡液内保存。五、受者手术（一）大鼠心脏腹部异位移植术：从腹正中线开腹，自制S型拉钩将腹壁牵向两侧，充分暴露手术野，进入腹腔后将肠袢推向右侧，以温盐水纱布盖好。打开后腹膜，在肾静脉水平以下将腹主动脉和下腔静脉在血管稍外和两侧软组织游离。在肾血管和髂血管分叉以上分离结扎两侧的腰静脉，并将下腔静脉背侧2～3条分支结扎，用2只哈巴狗夹分别在肾血管下方和髂血管分叉上方约5mm处阻断腹主动脉和下腔静脉，用尖刀在腹主动脉前壁挑开一小口，然后用显微弹簧剪延长切口大约与供心的升主动脉口径相当，用含肝素（25IU/L）的盐水冲洗吻合口内血块，于下腔静脉前壁同样挑开一个小口，由于下腔静脉壁薄，预防将其后壁同时挑开，然后同样的用显微弹簧剪将其切口扩大，与供心肺动脉口径相当即可，同样用肝素盐水冲洗血管腔，将血管腔内的凝血块冲出。下腔静脉开口一般在腹主动脉开口的下方，位置稍有一定的偏移，避免在一个平面上。从0℃～4℃的保存液中取出心脏，以冰盐水棉片保护供心，棉片周围覆以冰屑以防在受者腹腔移植心复温。用8－0的无创缝合线先将供心的主动脉和受者的肺动脉切口对角缝合2针，然后先内侧壁，后外侧壁，从右向左进行连续缝合，针距和边距均为0.3～0.5mm。同样，用8－0无创缝合线将供心主肺动脉与下腔静脉切口对角缝合两针，然后在下腔静脉腔内从右向左连续缝合内侧壁，继而从左向右在下腔静脉强外连续缝合外侧壁，针距和边距均为0.3～0.5mm。缝合静脉吻合口时，注意勿过度用力拉紧缝线，以免造成流出道狭窄。缝合最后2针前，用钝性弯针头向吻合口腔内注入25IU/L肝素盐水，排除残留空气，以防气栓形成。吻合完毕，先松开远心端哈巴狗，然后再缓慢松开近心端哈巴狗，同时观察动脉吻合口有无喷射状出血，如果有喷射状出血可再次阻断血管后给予修补，如有渗血，用棉球压迫止血，循环开放后心脏颜色立即变为鲜红，2～3分钟后心脏由室颤变为有力收缩。检查吻合口有无出血，如无出血将肠管推回腹腔，缝合关闭腹腔。图1供心主动脉与受者腹主动脉端侧吻合图2供心肺动脉与受者下腔静脉端侧吻合（二）大鼠心脏颈部异位移植术：受者腹侧向上，头对术者，其上门齿用一橡皮筋拉伸固定，剃毛后自下颏中点至右锁骨中点作一皮肤切口，自锁骨处游离右外静脉直至其分叉处，沿途各细小属支均结扎切断或用笔式电灼器离断，切断右胸锁乳突肌以暴露右颈总动脉，于气管食管沟右侧可以找到右颈总动脉，打开颈总动脉鞘，游离右颈总动脉后，于其近端上一无创性显微血管夹，远端结扎切断，取出供心，在吻合过程中要不断以0℃～4℃冰平衡液淋浇，避免复温。在10倍镜下用10－0的无损伤显微缝线行供心无名动脉与受者颈总动脉单线连续或间断缝合，先行前壁腔外连续缝合，缝至血管后壁时可将心脏向右扭转以获良好暴露，然后行后壁腔外连续缝合，间距0.5mm，边距0.4mm。180g大鼠颈总动脉直径约1.5mm，约需缝6～8针，于右颈外静脉靠近锁骨处上一无创性显微血管夹，之后结扎切断颈外静脉远心端分叉处，用8－0无损伤血管缝线行供心主肺动脉与受者右颈外静脉单线连续端端缝合，先行后壁腔内连续缝合，缝至前壁时转为腔外连续缝合，间距0.6mm，边距0.5mm。180g大鼠颈外静脉中段直径约2.5mm，约需缝8～10针。缝合完毕后，依次开放静脉和动脉血流，1min内即可见到供心由纤颤变为规律复跳，摆正移植心位置，注意勿使血管扭曲。单层缝合关闭切口。图3大鼠颈部心脏移植示意图六、围手术期注意事项以及并发症的防治无论腹部还是颈部心脏移植移植心的循环途径为：受者动脉－供者心脏升主动脉－冠状动脉－心肌－冠状静脉－右心室－肺动脉－受者静脉。左心不参与血液循环，无射血功能。合格移植模型的制备，需在统一和标准手术操作下进行，达到稳定的手术成功率和很高的重复性，基于这一要求，如何预防围手术期并发症的发生，成为手术成功和稳定性提高关键因素1.选择健康大鼠作为供者和受者。在移植术前严格选择健康个体进行实验，是保证手术成功的基本条件。2.防止麻醉意外。戊巴比妥钠用量稍大即可能造成呼吸抑制或骤停，用量应谨慎，如出现呼吸抑制，可术中给予小剂量的阿拉明滴入腹腔使呼吸兴奋，如动物苏醒，可间断给予乙醚开放吸入，能较好的控制麻醉深度，术毕动物苏醒较快。3.良好的供心获取和保护。良好的供心切取和保护应做到：（1）先游离和准备好受者待吻合的血管后，再获取供者心脏，可明显缩短冷缺血时间，促进供者心脏复跳。（2）供者全身肝素化时注入冷肝素盐水，并在开胸后迅速使供者心脏降温并停博，可减少供者心脏在无氧代谢下的能量消耗。（3）升主动脉和肺动脉在分支近端剪断时，要确保留取的供者血管长度能满意吻合。（4）术中应注意用冰屑使供者心脏持续降温，避免在受者体内复温，降低能量消耗。4.防止术中出血。体重300g的大鼠，总血容量约20ml，出血3ml即可发生休克。应注意：（1）结扎下腔静脉向背侧的交通支时，易误伤引起出血，且止血较为困难，应在吻合段两端轻提腹主动脉，直视下从无血管区引线，单次或分次轻柔结扎，如结扎不完全，吻合口内将不断有血液溢出，不仅操作困难，还可能引起失血性休克；（2）吻合口出血是术中出血的主要原因。受者血管切口应比供者心脏血管口径稍小一点，可避免打结时因张力过大而撕扯血管壁，供者、受者血管对角固定后连续缝合的第一针，针距要小，以后的针距要保持均匀一致，吻合完成后，先开放远端血管夹，静脉吻合口内少量渗血经压迫后，通常能自行停止，试放近端血管夹检查动脉吻合口时，如有少量出血，可多次间断放松血管夹，动脉血压力使吻合口缝线排列更趋均匀，并使针眼处有凝血的机会，如动脉出血仍未停止，需在出血的部位加缝1～2针。止血后按出血量不液；（3）心耳损伤也是造成术中出血的原因，获取供者心脏过程中，剪断供者胸主动脉和肺动脉时易误伤左、右心耳，因此，在供心切取时最好将心耳一起结扎，供者心脏移植时应用棉片保护心耳，防止血管吻合时针尾误伤心耳，心耳损伤后极易出血，压迫止血通常无效，需结扎出血部位。5.防止静脉回流障碍。发生静脉回流障碍时，移植心脏颜色逐渐由鲜红逐渐变为暗红，体积增大，淤血，变硬，博动无力，主要原因是供者静脉扭曲、吻合口太小或吻合技术不佳，肺动脉壁菲薄且柔软，应暴露清楚，辨认无扭曲后与受者吻合口不对称定点，受者下腔静脉吻合口不应小于主动脉吻合口，否则，肺动脉吻合口会出现相对性狭窄，导致移植心回流不畅，从受者远端向近端吻合静脉右侧壁时，最后2针易误缝到受者下腔静脉后壁，或打结后引起吻合口近端缩短，如从右侧壁两端向中间缝合，可确保不误缝至对侧壁。6.预防截瘫。在腹部大鼠心脏移植模型中，有时候会发生截瘫，截瘫的主要原因是腹主动脉阻断时间过长引起脊髓供血障碍，且腰静脉结扎后不能形成侧支循环，主动脉阻断60min后，脊髓局部血流可从20ml/100g/min减少到1.8ml/100g/min。术后如有低血压，这是早期脊髓血液循环处于极不稳定的平衡状态，非常容易因血液动力学紊乱导致神经损伤。此外，吻合动脉时将吻合口远端缝闭也是引起截瘫的原因之一，提高手术技巧，缩短动脉阻断时间是防止缺血性脊髓损伤的主要措施。7.注意保温。大鼠在麻醉体温下降明显，对机体的正常代谢和生理功能必然产生一定的影响。手术应在恒温条件下进行，术中肠管用温盐水纱布保护以保温和减少体液丢失，手术结束后应将受者置于保温环境中，尤其是在寒冷季节更应注意。8.预防感染虽然大鼠心脏移植手术只需行清洁手术，但在现有手术室，术后饲养环境及术后免疫抑制剂干预等情况下，仍有引起感染的可能，故在缝合切口前，腹腔常规给予抗生素预防感染。