天漠总体甲基化水平测定翻译

说明样本来源——纯化基因组DNA、质粒DNA、PCR扩大产品、水或三乙二胺四乙酸等中的DNA片段。DNA总量——此协议输入100ngDNA/孔最优，兼容范围为10-200ngDNA。检测——每100ng单股DNA中含量大于等于0.5%的5-甲基胞嘧啶。必要设备——孵化器和ELISA酶标仪。推荐使用多孔移液器。堵塞步骤和清洗步骤可能用到自动洗板机。产品描述在表观遗传学的研究中，必须要准确地检测和定量DNA甲基化作用（如5-甲基胞嘧啶）。迄今为止，人们已为此开发了很多方法，比如高性能毛细管电泳方法，亚硫酸盐测序方法和甲基化DNA免疫沉淀反应方法。5-mCDNAELISA试剂盒是一个方便且强大的工具，这种试剂盒可以让研究者在不到3小时的时间内，准确定量任何DNA样本中的5-mC。该套件采用了独特的抗5-甲基胞嘧啶单克隆抗体，对5-mC同时具有特异性和灵敏性。这种方法可以广泛地检测脊椎动物、植物、微生物以及PCR扩增和片段化的DNA。5-mCDNAELISA试剂盒可以准确地通过专门设计控制的标准曲线定量DNA样本中5-mC的百分比。此外，高通量分析的工作流程可以达到理想中的快速、高效。。实验注意事项试剂盒中使用（参照第4页的涂装工序）的所有DNA必须变性（单链）。为了检测每孔100ng已变性的双链DNA中的5-mC，需要使该协议优化。所有样品要分为两份检测（意味着检测时需要使用总共200ng的DNA）。但是，根据您的实验设计，10-200ng的DNA样本都可以检测。注意：当每孔输入量超过100ng时，一定要调整使用的控制DNA的量，使其与样品的使用量相等。这将确保5-mC定量百分比的准确性。阴性和阳性对照取决于100ng/μl的双链DNA的浓度，并且可以检测或量化DNA中的5-mC。检测5-mC时，应同时测定这两种对照。定量5-mC时，应进行阴性对照和不同比例的阳性对照，并构建标准曲线（见附录第五页）。所有标准试剂都应一式两份进行检验。二次抗体是浓度为1ug/μl的辣根氧化物（HRP）缀合物。避免冷冻或循环解冻；根据需要可以等分抗体的数量，并长期将其保存在-20℃。解冻后的抗体可以在4℃条件下保存很短时间（约1星期）。缓冲液的储存在室温或者4℃下的延展周期时间内，5-mC涂层缓冲液可以稳定存在。5-mCELISA缓冲液应在4摄氏度条件下储存，并在6个月内使用完毕。此外，缓冲液可以分配成多个等份，也可以长期储存在-20℃的条件下。注意避免重复冷冻/解冻的循环。HRP显影剂要在4摄氏度条件下保存，并在6个月内使用完毕。请不要冰冻此显影剂。在添加显影剂进入孔隙前，将其置于室温可以更迅速地显色。协议此协议在每孔100ngDNA时最优。为准确地发现和定量5-mC，推荐使用双份样品。DNA涂层1.移动必要数量的孔带以检验DNA样本并且控制DNA样本。2.在PCR管中添加100ng的每种DNA，并使5-mC涂料缓冲液体积到达100μl。举例：如果DNA浓度是20ng/μl，则添加5μl的DNA到95μl的5-mC涂层缓冲液中，使得溶液的最终体积为100μl。3.将DNA置于热循环仪中，在98℃条件下处理5分钟，使其变性。变性后，立即将其冰冻10分钟。4.把所有变性DNA（100μl）添加到板的孔中，并用薄片覆盖，在37℃条件下培养1小时。模块：1.丢弃孔隙中的缓冲液。2.用200μl的5-mCELISA缓冲液洗涤孔三次。丢掉每次洗涤后的缓冲液。3.在每孔中加入200μl的5-mCELISA缓冲液。用金属薄片覆盖并在37℃条件下培养30分钟。添加抗体：1.丢弃孔隙中的缓冲液。2.准备混合抗体，此混合抗体在5-mCELISA缓冲液中由Anti-5-Methylcytosine和二次抗体按照此表混合而成。3.向每孔中添加上述混合抗体100µl。用金属薄片覆盖并在37℃条件下培养30分钟。显色：1.丢弃孔中的混合抗体。2.用200μl的ELISA缓冲液洗涤孔三次。3.向每孔中添加100μl的HRP显影剂。室温条件下，10-60分钟内可以显色。4.在405-450nm条件下，使用一个ELISAplatereader，测量吸光率。附录-DNA阴性对照和阳性对照的分析。检测5-mC通过对比阴性对照（0%甲基化作用）和阳性对照（100%甲基化作用）的吸光率，可以确定5-mC的存在与否。定量5-mC要确定一份DNA样品中5-mC的含量，需要绘制标准曲线。准备已知的5-mC不同百分比含量的阳性对照来绘制标准曲线（见下表）。这些对照需要在变性之前准备好，并与样本同时进行分析。每种混合液均添加1μl到PCR管中，用5-mC涂层缓冲液补充体积至100μl。接下来的步骤与协议中涂层步骤三相同。稀释体积（µl）举例（18孔）5-mCELISA缓冲液N/A(#wells+2)1002000µlAnti-5-Methylcytosine1:2000缓冲液体积/20001µl二次抗体1:1000缓冲液体积/10002µl%5-mC阴性对照（100ng/μl）阳性对照（100ng/μl）0%10.0μl0μl5%9.5μl0.5μl10%9.0μl1.0μl25%7.5μl2.5μl50%5.0μl5.0μl75%2.5μl7.5μl100%0μl10.0μl此表格重点使用7种阴性对照和阳性对照的混合物来绘制标准曲线。每孔溶液的总体积是10μl，浓度是100ng/μl。每个混合溶液的吸光度要绘制成函数曲线，这个曲线是绘制在以吸光度@405nm为Y轴与5-mC百分含量（X轴）的直角坐标系上。使用下列等式，基于其吸光度确定其DNA样本的5-mC的百分比（未知）。此等式是由对数衍生出来的二阶回归。注意：阳性对照和阴性对照的DNAs是来自于大肠杆菌基因组DNA。阳性对照DNA已用CpG甲基化酶（目录＃E2010/11）处理过。CpG二核苷酸密度在物种之间是变化的，为定量5-mC的变化，只需要简单地求出大肠杆菌和样品的物种中的CpG密度的倍数差异，然后乘以所计算的5-MC的百分含量。例如，大肠杆菌的CpG密度/基因组的长度为0.075，鼠类的CpG密度/基因组的长度为0.0081，因此，大肠杆菌和小鼠的CpG密度之间的倍数差异是9.22