细胞培养流程

北京协和医院中心实验室实验指南细胞培养流程秦伟2012-12-28目的及应用：用于细胞传代试剂及设备：培养基，0.25%胰酶，75%酒精，95%酒精，细胞培养箱，超净台，手套，酒精灯，吸管，移液管（5ml，10ml），50mL离心管，培养瓶（25cm2），移液枪，离心机，计时器，真空泵，抽滤瓶，水浴锅，记号笔，冰箱实验原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。实验步骤：以Hela细胞为例说明具体实验操作步骤：一．实验前准备工作进细胞室先换拖鞋，带上手套75%的酒精进行表面消毒；检查酒精灯有无95%酒精，电枪有无电；将实验过程中用到的实验器材（包括培养瓶、50mL离心管、移液管）放于安全柜里，实验前安全柜开紫外照15~20min；将细胞培养液放于37℃水浴中预热；抽滤瓶与真空泵相连，废弃缸套袋。二．准备实验北京协和医院中心实验室实验指南先关闭紫外灯30min后再进行实验；75%酒精喷于纱布上，将超净工作台仔细擦试干净；点燃酒精灯，小心的将细胞从孵箱中拿出。1．吸除旧的DMEM培养液：拿出吸管（要拿吸管的上端），插入与抽滤瓶相连的橡胶管中，在酒精灯外焰灼烧灭菌，细胞培养瓶倾斜将吸管插入瓶底部一角，吸出旧的DMEM培养液，将用后的吸管弃于废弃缸里。注意：一定要吸除干净，否则消化时间过长，细胞损伤过大。2．消化：拿出5mL移液管，插入电枪中，酒精灯过火灼烧，吸取2mL0.25%胰酶加入培养瓶中，混匀，放于37℃孵箱中消化5-6min。取下用后的移液管。3．中和：从孵箱中拿出培养瓶，显微镜下观察细胞是否被完全消化下来，5mL灭菌后移液管加入3mLDMEM培养液终止消化。反复吹打混匀；吸出中和液转移到50mL离心管中。4．离心收集细胞：配平后离心200×g，3min。将新的DMEM培养液加入新培养瓶中，2mL／瓶（培养瓶底面积为25cm2）。5．重悬细胞：离心后吸出中和液，（先吸出表面泡沫，一定注意不要吸出细胞）。加入新DMEM培养液（按2mL／瓶和细胞传代数计算加入的培养液体积），用电枪反复吹打使细胞充分混匀，要尽量减少产生气泡。6.分装：混匀后将细胞分装，按2mL/瓶得体积加入培养瓶中，充分混匀。记号笔标记细胞名称，培养液，细胞传代数，传代日期，实验人员。7．培养：将细胞放于37℃，5%CO2细胞培养箱培养。将0.25%胰酶，细胞培养液密封好放于4℃冰箱中保存。8．清洁超净台实验完毕后，盖灭酒精灯，关闭真空泵，用酒精棉球擦干净操作台表面。北京协和医院中心实验室实验指南9．观察：每天观察细胞，并记录细胞生长状态。注意事项：1．紫外消毒过程中会产生臭氧分子，对人体有害。一般情况下，消毒后至少半小时后再进入。2．所有的实验器材都要经过消毒处理；所有的细胞操作都在安全柜中进行，每一步都要注意不能用手碰到瓶口，培养液不能碰到瓶口，拿培养瓶时要使培养瓶的瓶口微微翘起。3．细胞消化时间不能太长，要让细胞尽快脱离不舒服的环境；离心时离心机转速不能太高，实验前要设定好离心转速和时间；重悬细胞时要保证细胞完全混匀，在显微镜下观察细胞是一个一个的。4．传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。5．每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。