实验十三动物组织核酸的分离鉴定和含量测定

DNA的定量和纯度测定实验目的：学习并掌握紫外分光光度法和定糖二苯胺显色法测定DNA含量和纯度的基本原理紫外分光光度法（此法要求核酸纯度很高，1个Abs相当于50ug/ml双螺旋DNA,除了定量测定以外还可进行核酸纯度的检测，A260/A280比值，纯的DNA为1.8，RNA为2.0，样品中含有蛋白质和苯酚时，A260/A280比值降低。）定糖法（DNA糖部分为脱氧核糖，RNA糖部分为核糖，分别可以进行二苯胺显色法和地衣酚显色法）定磷法（核酸的磷酸部分）DNA测定的方法原理二苯胺显色法原理DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物质，在595nm波长处有最大吸收。DNA在40~400μg范围内，光吸收与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。实验内容DNA：1mlSC溶液溶解上次提取的DNA样品，然后转移到50ml离心管中，用9ml0.01MNaOH溶液溶解。A260测定:以H2O作为空白，取上清测A260值后确定稀释倍数，使A260值在2.0左右（DNA此时的浓度约为100ug/ml。（由于二苯胺法的测定范围是40-400ug/mlDNA，所以DNA浓度如果太小会影响测定结果）核酸含量（ug/ml）=样品A260X稀释倍数/0.02(0.022)A280测定：A260/A280比值计算。纯的DNA为1.8，RNA为2.0。如果样品中混有RNA，则比值大于1.8；如果样品中混有蛋白质，则比值小于1.8。DNA标准曲线的制作和样品测定试剂管号0对照12345样品1样品2DNA标准溶液,ml0.00.40.81.21.62.02.02.0蒸馏水，ml2.01.61.20.80.4000二苯胺试剂,ml4.04.04.04.04.04.04.04.0OD595注：待测溶液中的DNA含量应调整至标准曲线的可读范围内。样品1和样品2为不同稀释倍数的DNA溶液。按上表加完各试剂后，充分混匀。于60℃水浴中保温1h，冷却后于595nm波长处以0管为空白调零，测定各管光密度（OD595nm）。以DNA的含量为横坐标，光密度（吸收值）为纵坐标，绘制标准曲线。DNA含量计算DNA含量计算：以样品的光密度，根据标准曲线计算出相对应DNA含量。并同紫外法测定的值进行比较。附注：二苯胺试剂具有腐蚀性，且二苯胺反应产生的蓝色不易褪色，操作中应防止洒出，比色时，比色杯外面一定要擦干净。