实验报告二产酶微生物的分离纯化与选育

产酶微生物的分离、纯化与选育实验目的1、学习从自然界中分离蛋白酶产生菌并纯化；2、通过实验观察紫外线和亚硝基胍等理化因素对微生物的诱变效应，并掌握基本方法；实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品（或其他样品）悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛。也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。基因突变可分为自发突变和诱发突变。许多物理因素、化学因素和生物因素对微生物都有诱变作用，这些能使突变率提高到自发突变水平以上的因素称为诱变剂。紫外线（UV）是一种最常用的物理诱变因素。它的主要作用是使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶间形成二聚体，阻碍双链的分开、复制和碱基的正常配对，从而引起突变。紫外线照射引起的DNA损伤，可由光复活酶的作用进行修复，使胸腺嘧啶二聚体解开恢复原状。因此，为了避免光复活，用紫外线照射处理以及处理后的操作应在红光下进行，并且照射处理后的微生物放在暗处培养。试剂距离地面十公分的土壤、酪素培养基实验器材恒温培养箱、恒温水浴锅、酒精灯、培养皿×8、试管×11、玻璃棒、移液管、量筒、三角瓶、烧杯、滴管、涂布器、血细胞计数板、移液枪、显微镜、紫外线等（15W）、磁力搅拌器、台式离心机、震荡混合器等实验方法与步骤1、酪素培养基的配置：牛肉膏3g、NaCl5g，酪素10g，琼脂20g，水1000mL，pH7.6-8.0。配制方法：称取酪素4g，先用少量2%NaOH润湿，玻璃棒搅动，再加适量的蒸馏水，在沸水浴中加热并搅拌，至完全溶解，补足水量至1000mL，加入其他成分，调整pH值，灭菌备用。2、菌悬液的制备取土壤20g，加水200ml，即梯度为10ˉ1的菌悬液，取1ml10ˉ1的菌悬液，加9ml的蒸馏水，即梯度为10ˉ2的菌悬液，按上述的方法步骤制作梯度为10ˉ3、10ˉ4、10ˉ5的菌悬液。将制作好的菌悬液做好标记，至温度为80℃的水浴锅热处理30min。3、接种与培养：在超净台将上述经过热处理菌悬液按下表接种接种梯度10ˉ110ˉ210ˉ310ˉ410ˉ5培养皿接种个数12221菌悬液接种滴数22222用涂布器涂均匀。放在温度为32℃恒温培养箱倒置培养48h。4、菌种的选育：菌悬液的制备①取培养48小时生长旺盛的出发菌株斜面1支，取2环接入10ml无菌生理盐水菌中，倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。②将上述菌液离心（3000r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2-3次，最后制成菌悬液。③用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。平板制作：将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板27套，凝固后待用。紫外线处理：①将紫外线灯开关打开，预热约20分钟。②取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述调整好细胞浓度的菌悬液3ml，并放入一根无菌搅拌棒于平皿中。③将上述2套平皿先后置于磁力搅拌器上，打开皿盖，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟和3分钟。盖上皿盖，关闭紫外灯。稀释：在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。涂平板：取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。培养：将上述涂匀的平板，用报纸包好，置37℃培养48小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。计数：将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。100对照每毫升活菌数处理后每毫升活菌数存活率%对照每毫升活菌数处理后每毫升活菌数对照每毫升活菌数致死率-×100%观察诱变效应：将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5-6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。数据处理产酶微生物的分离与纯化结果：五种梯度的培养基都长有菌种，其中以10ˉ5梯度的培养基中菌种长势最佳，菌种成白色，大多为单菌落，并且在单菌落外形成了透明的水解圈。紫外诱变结果表2紫外线诱变结果诱变效应记录表表3诱变效应记录表诱变剂处理时间（min）平均菌落（数/皿）稀释倍数10ˉ410ˉ510ˉ6存活率%致死率%紫外线（UV）0（对照）269241210124523214084.67%15.33%222815912369.77%30.23%处理结果透明圈和菌落直径大小（mm)及其HC比值123456透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值UV处理1min871.143871.143871.143761.167541.250651.200UV处理3min1052.000942.250842.0001462.3331042.500942.250对照1772.4291362.1671252.4001371.8571052.0001152.200实验结论土壤中存在大量的产酶的芽孢杆菌，经酪素培养基培养后能形成透明的水解圈；紫外线对微生物能产生诱变效应，紫外线照射的时间不同产生的诱变效应不同。误差分析影响紫外线诱变效应的原因主要有：一、培养基的PH不适合产酶芽孢杆菌的生长和繁殖，倒置诱变的细胞补足；二、在做菌悬液稀释时没有标准稀释，浓度还是太高，经培养后菌落太密集，紫外线诱变结果计数不准确；三、在紫外线照射时，稀释液离紫外灯补足30cm或超过30cm，或培养皿盖没有打开，或时间不足或时间超过，这些都会引起紫外诱变效果。