实验指导手册[学生版]

制药工艺学实验学习指导书（第六版）西南科技大学生命科学与工程学院二○一二年二月实验一离子交换层析分离混合氨基酸一.目的要求学习采用离子交换树脂分离混合氨基酸的基本原理并掌握离子交换层析法的基本操作技术。二.实验原理离子交换层析法主要是根据物质解离性质的差异进行分离的方法。本实验用苯乙烯性季铵型阴离子交换树脂分离酸性氨基酸（天冬氨酸pI=2.77）以及碱性氨基酸（赖氨酸pI=9.74）的混合液。在特定的pH条件下，它们与树脂的结合能力和解离程度不同，通过改变洗脱液的pH值或盐离子浓度可进行分离。三.实验器材和试剂1.苯乙烯性季铵型阴离子交换树脂（201×7，717型，100-200目）2.1mol/LHCl、1mol/LNa0H3.标准氨基酸溶液：天冬氨酸、赖氨酸各称量100mg，混合加入ddH2O20ml，置棕色滴瓶避光保存。4.洗脱液（pH4.2的柠檬酸缓冲液）：0.lmol／L柠檬酸54m1加0.1mol／L柠檬酸钠46ml5.氨基酸显色液（茚三酮溶液）：2g茚三酮溶于100mL无水乙醇中。6.砂芯层析柱（Ф1×20cm）、试管（Ф1×12cm）及试管架（40孔）、铁架台（带夹）、胶头长滴管、牛角药匙、橡皮筋（捆试管）、250ml抽滤瓶（带砂芯漏斗）、称量纸、pH试纸（1-14）（0.5-5）7.电子天平（千分之一）、恒温水浴锅、真空泵四.实验方法1.树脂的处理：100ml烧杯中置约10g树脂，加25ml1mol/LHCl搅拌2h，倾弃酸液，用ddH2O充分洗涤树脂至中性。加25ml1mol/LNaOH至上述树脂中搅拌2h，倾弃碱液，用ddH2O充分洗涤至中性。再用1mol/L盐酸浸泡2h，转型为Cl-型，最后再用ddH2O充分洗涤至中性备用。（教师准备）2.装柱：取洁净干燥Ф1×20cm砂芯层析柱1支，用夹垂直固定于铁架台上，关闭下端出口，自顶部沿管壁缓慢加入ddH2O，待液面高于砂芯2cm处停止。然后自顶部缓慢沿壁用玻棒引流注入经处理的树脂的悬浮液（干树脂加少量ddH2O搅拌使树脂悬浮），待树脂沉降后，打开下端出口旋钮逐步放出过量的ddH2O（注意控制流速，保证液面高度不低于树脂层），再补加入一些树脂，直至树脂沉积至12cm高度即可。保持柱床表面水平（不水平，可以用玻棒适当搅拌调整）。当液面高出树脂表面1cm左右时，关闭柱子出口。3.加样、平衡：打开层析柱下端出口使ddH2O缓慢流出，待液面下弯月面几乎平齐树脂表面时关闭出口（不可使树脂表面干燥，否则加液时会混入气泡）。用胶头长滴管将5滴氨基酸混合液轻轻地滴加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内（1滴/3s）。当液面下弯月面刚平树脂表面时，关闭出口。这时以同样方式在柱顶缓慢注入ddH2O少许，并打开下端出口，开始平衡，出口溶液立即开始用试管收集，保持流速20滴／min（尽量准确），每管20滴，逐管收存，在收集同时注意用胶头长滴管补充柱床顶部ddH2O（加入时轻缓，勿扰乱柱床顶部也勿使树脂表面干燥）。在收集洗脱液的过程中，每5管需检验氨基酸的洗脱情况，方法如下：于各管洗脱液中加20滴（约1ml）氨基酸显色液，沸水浴中加热10min，如溶液显紫蓝色，表示已有氨基酸穿透下来。显色的深度可代表浓度，可进行比色测定。4.洗脱：在检测到第一个氨基酸穿透流出后，再收集两管茚三酮反应阴性部分，关闭层析柱出口，将树脂顶部的剩余ddH2O移去。这时在树脂顶部加入少许洗脱液，打开出口使其缓慢流入柱内，按上述操作方式用洗脱液洗脱并立即开始逐管收集（1滴／3s），每管20滴。同样每收集5管做次氨基酸制药工艺学实验学习指导书3检测，在第二个氨基酸完全洗脱下来以后，再继续收集两管茚三酮反应阴性部分。最后以洗脱液各管的颜色深浅（以加样洗脱液为空白，其余根据颜色状况以－、±、+、++……表示）为纵坐标，洗脱液管号为横坐标作图，画出洗脱曲线。5.树脂再生：实验结束后从柱中将树脂取出（用少量ddH2O和玻棒搅拌倒出），用2mol/LHCl浸泡2h，再用ddH2O洗至中性备用。若需长时间保存，请砂芯过滤后置于20%乙醇中避光保存。四.注意事项1.装柱时须防止气泡混入树脂层、分层及液面在树脂表面以下等现象发生。2.使用砂芯层析柱时，轻拿轻放，并注意保护好其它玻璃器皿。3.水浴时因茚三酮乙醇溶液挥发易引起手部皮肤染色，请尽量用试管夹或毛巾取放试管。五.实验结果及思考题绘制洗脱曲线并完成以下思考题1.离子交换树脂应如何保存？3.如果混合氨基酸中包含中性氨基酸丙氨酸，实验应如何设计？附录1：717型树脂特点别名：强碱性I型阴离子交换树脂CAS号：122560-63-8保存条件：常温含水量：40.0～50.0%交换容量：≥3.0mmol/g粒度（0.3～1.2mm）:≥95.0%型号：Cl-（氯型）性状：淡黄色透明球状颗粒。是在苯乙烯-二乙烯苯共聚基体上带有季铵基〔-N（CH2）3OH〕的阴离子交换树脂，该树脂具有机械强度好，耐热性能高的特点。本产品相当于美国AmberliteIRA-400，西德LewatitM500日本DiaionSA-10A用途：科研、实验附录2：茚三酮反应茚三酮反应：在弱酸条件下（pH5-7），蛋白质或氨基酸与茚三酮共热，可生成蓝紫色缩合物，只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质。附录3：20种氨基酸的性质制药工艺学实验学习指导书4实验二凝胶层析分离核黄素、蓝色葡聚糖和细胞色素C一.目的要求学习并掌握凝胶层析技术的工作原理和基本操作技术。二.实验原理凝胶过滤技术广泛应用于蛋白质、酶、核酸等生物高分子分离分析。它是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析方法。此类层析的固相载体是具有分子筛性质的凝胶，目前使用较多的是具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Biogel）以及琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose），此外还有这些凝胶的各类衍生物。葡聚糖凝胶是由一定分子量的葡聚糖（右旋糖苷）和甘油基以醚桥（-0-CH2-CH-CH2-O-）形式相互交联形成三维网状结构的一种水不溶性物质。通过控制交联剂环氧氯丙烷和0H单体葡聚糖的配比以及交联时的反应条件控制交联度而获得具有不同“网眼”的凝胶。“网眼”大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围，可分离的分子量从几百到数十万道尔顿不等。由于凝胶骨架中的多糖链含有大量OH基，因此凝胶具有极强的亲水性，能在水和电解质溶液中膨胀。不同型号的交联葡聚糖用G表示（如G-25，G-100等），G后面的数字为凝胶的吸水量（ml水/g干胶）乘以l0得到的数值，如G-100即表示此型号凝胶吸水量是10ml／g干胶。进行工作时一般根据欲分离物质的大小及工作目的来选择合适的葡聚糖凝胶装层析柱。待分离的物质通过此柱时，各组分相互之间由于分子量大小各不相同以及在固定相上的阻滞作用的差异而在柱中以不同的速率移动。分子量大于允许进入凝胶“网眼”范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，移动速度快而先流出层析柱；分子量小的物质可完全渗入凝胶颗粒，阻滞作用大，流程长，移动速度慢，从层析柱中流出就较晚。若物质分子量介于完全排阻和完全渗入的凝胶物质的分子量之间，则在二者之间从柱中流出。由此就可达到分离的目的。对于混合物中某一被分离成分在凝胶层析柱内的洗脱行为，常用分配系数Kd来度量。Kd=ieVVV0式中V0--外水体积，即凝胶柱中凝胶颗粒之间所含水或缓冲液体积Vi—内水体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积；Ve—洗脱体积，即被分离成分通过凝胶柱所需洗脱液的体积。当一种被分离成分的分子全排阻时，其洗脱体积就是V0，而如果其分子直径小于凝胶孔径下限时，其洗脱体积为V0+Vi.在一般情况下，Kd值分布在0和1之间，即0≤Kd≤1，而洗脱峰都出现在V0≤Ve≤V0＋Vi之间。本实验采用葡聚糖凝胶G-100作为固相载体，它适用于分子量范围在4000～150000之间的多肽与蛋白质的分离。当核黄素（分子量376）、细胞色素C（分子量12000）和蓝色葡聚糖（分子量200000）混合物流经层析柱时，蓝色葡聚糖分子量最大，最先流出；细胞色素C第二个流出；核黄素由于完全渗入凝胶颗粒内部而最后流出。通过洗脱曲线可以清楚地观察出葡聚糖凝胶G-100对三种物质的分离效果。鉴于凝胶是一种不带电荷的惰性物质，本身不会与被分离物质相互作用，因而分离效果好，重复性高。凝胶过滤所需仪器设备简单，操作简便，每次样品洗脱完毕则已经再生，可反复使用。这些优点使凝胶过滤法成为一种应用广泛的分离分析方法。三.实验材料制药工艺学实验学习指导书5（一）试剂1.SephadexG-1002.细胞色素C3.蓝色葡聚糖20004.核黄素5.洗脱液：0.05mol/L的NaCl溶液6.无水乙醇（二）器材1.玻璃层析柱：Ф2.6×20cm1支。2.50ml、100ml烧怀各1只。3.胶头长滴管1支，玻璃棒l支。4.1.0×12cm小试管30支。5.40孔塑料试管架1个。6.铁架台（带夹子）7.抽滤瓶、砂芯漏斗各1个四.实验方法1.样品准备：取蓝色葡聚糖0.01g，0.02g核黄素和0.1g细胞色素C，用20ml蒸馏水溶解，滤纸过滤备用（可根据实验颜色深浅调整）。2.凝胶的准备与装柱：称取10gSephadexG-100，加蒸馏水300ml，室温溶胀4h。用倾泻法除去凝胶上层水及细小颗粒，反复以蒸馏水洗涤直至液面无细小颗粒为止，然后放在抽滤瓶内，水泵抽气脱气，最后保存于蒸馏水内备用。取Ф2.6×20cm洁净干燥的砂芯层析柱，关闭出口，加入5m1蒸馏水，使液面高于砂芯2cm，然后将溶胀后的凝胶搅匀并沿壁玻棒引流加入柱中，待柱底凝胶沉积高度1cm时，打开柱的开口，继续装柱至柱床高度为4cm，关闭出口。装柱过程严禁产生气泡及柱床分层，如有气泡及分层应重装。装完后，用细玻捧轻轻搅动柱表面，待凝胶自然沉降形成平面后。再用20ml（1BV）洗脱液按流速2ml/min洗涤至柱床表面不再下降，使柱床稳定。3.样品分离：打开层析柱出口，使柱面溶液缓慢流出，直至床面与液面刚好齐平为止（注意，不可使床面液体流干!）。关闭出口，将20滴样品混合液（1ml=1/20BV）直接滴加于柱面中心，勿使床面扰动，打开出口，让样品液进入柱子（下端流速3滴/s），待样品液进入凝胶填料后，开始用洗脱液洗脱并同时开始收集（柱顶用胶头滴管不断补充洗脱液，操作轻微，勿扰动柱床），控制流速大约20滴／min，每管收集20滴，至黄色核黄素完全洗脱出来后停止收集，观察洗脱液颜色，最后以洗脱液各管的颜色和颜色深浅（以－、±、+、++、+++……表示）为纵坐标，流出液体积为横坐标作图，即可画出一条洗脱曲线。五.注意事项1.在处理凝胶时，应使之充分吸水溶胀，注意避免剧烈搅拌，以防止破坏交链结构。2.装柱时，凝胶液不可太稀或太粘稠。若太稀，分几次装出的凝胶床往往会分层，不均匀；而过于粘稠时，会吸留气泡。3.为了获得较好的分离效果，得到清晰的分离区带，起始区带必须尽量狭窄。因此加样量要少，一般最多不能超过床体积的20％。4.严格控制洗脱速度，不宜过快否则可导致分离不完全。六.思考题绘制洗脱曲线，并测定层析柱内径及柱床高度，Vi和V0，并求出细胞色素C分配系数Kd。制药工艺学实验学习指导书6附录一：SephadexG-100吸水量10ml/g干胶，溶胀体积15ml/g干凝胶，肽和球状蛋白质4000-150000，多糖1000-100000，浸泡时间20℃，72h；100℃，5h。附录二：核黄素维生素B2分子式:C17H20N4O6分子量:376.37化学文摘登记号:CAS83-88-5理化性质：黄色至橙黄色结晶性粉末，有多种晶型，微臭，味带苦。约于280℃度熔化并分解。比旋光度：-115°~-140°。饱和水溶液呈中性，呈淡黄绿色，有荧光。干燥时不受散射光的影响，但在溶液中光线可导致其变质。中性或酸性下极稳定，