实验方案采用篇

良肤乳膏各成分的透皮特性研究一、良肤乳膏各成分的理化性质研究:溶解性能，分配性能，解离性能（已完成）二、良肤乳膏中各成分的检测方法的建立1、良肤乳膏中个单一成分的HPLC条件的建立：丹皮酚色谱条件为甲醇：水（45:55），十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂，C18柱，流速为1ml/min检测波长为244nm(药典条件)。对照品的制备：称取适量的丹皮酚对照品于50ml容量瓶中，用甲醇溶解，制成20μg/ml的对照品溶液。供试品的制备：取丹皮酚提取物适量于50ml容量瓶中，用甲醇溶解，制成一定浓度的供试品溶液。梣酮，以十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂，以甲醇：水（60:40）为流动相，检测波长为236nm，理论塔板数按梣酮峰计算不得低于3000；对照品的制备：称取适量的梣酮对照品于50ml容量瓶中，用甲醇溶解，制成60μg/ml的溶液即得。供试品的制备：取白鲜皮提取物适量于50ml容量瓶中，用甲醇溶解，制成一定浓度的供试品溶液白鲜碱：以十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂，以甲醇：水（52:48）为流动相，检测波长为220nm，柱温30℃对照品的制备：精密称取白鲜碱对照品适量于50ml容量瓶中，加甲醇制成供试品的制备：取白鲜皮提取物适量于50ml容量瓶中，用甲醇溶解，制成一定浓度的供试品溶液甘草次酸：以十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂，流动相为乙腈：0.05%磷酸水梯度洗脱，检测波长234nm，理论塔板数按照对照品的制备：精密称取甘草次酸对照品适量于50ml容量瓶中，加甲醇溶解制成供试品的制备：取甘草提取物适量于50ml容量瓶中，用甲醇溶解，制成一定浓度的供试品溶液在经过良肤乳膏各成分的透皮特性实验后，将会根据实验数据，将良肤乳膏的各成分作拆方组合处理，采用数理统计的方法，对组合后的方案进行方法学考察以及相互影响的验证试验。2、标准曲线的绘制：分别配制五个不同浓度的丹皮酚（梣酮，白鲜碱，甘草次酸）的对照品溶液，进行液相分析，根据实验数据绘制标准曲线。3、线性范围的考察：精密配制一系列浓度的丹皮酚、白鲜碱、梣酮及甘草次酸对照品溶液，按色谱条件进样分析，将各对照品溶液的浓度C与峰面积A进行线性拟合，4、方法回收率精密吸取6份已知含量的丹皮酚、白鲜碱、梣酮、甘草次酸供试品1ml，分别精密加入一定量的丹皮酚、白鲜碱、梣酮、甘草次酸对照品，按供试品溶液的制备及上述色谱条件操作，计算回收率。回收率%=（C-A）/B×100%式中A为供试品所含被测成分量；B为加入对照品量；C为实测值。5、精密度试验：粗密吸取丹皮酚、梣酮、白鲜碱、甘草次酸对照品溶液20μl，重复进样5次，测定丹皮酚、梣酮、白鲜碱、甘草次酸的峰面积，计算RSD（精密度系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差的相对标准偏差表示。三、透皮实验1、实验动物皮肤的选择（猪皮，有毛大小鼠皮肤，裸鼠皮肤，蛇皮，尸皮，病变皮肤,人造皮肤，人工膜）1.1实验动物皮肤的制备:小鼠，用眼科剪剪去腹部的毛，脱颈椎处死，取腹皮，置于玻璃平板上，除去粘连物与脂肪组织，用双蒸水洗净，浸泡在生理盐水中，置于4度冰箱中保存备用。大鼠：脱颈椎处死，用眼科剪将腹部的毛剪短，用自制的脱毛剂涂抹于短毛处，待一段时间后，用温水将脱毛膏洗去，用干纱布或棉花将皮肤擦净，取腹部皮肤，置于玻璃平板上取出皮下脂肪组织与粘连物，用双蒸水洗净，置于生理盐水中，于4度冰箱中冷藏备用。猪皮：将市售的猪皮用双蒸水洗净，用拔毛法将皮肤表面的猪毛除去，将皮下脂肪层与粘连物去除，置于生理盐水中，放置在4度冰箱中保存备用。蛇皮：洗净，置于生理盐水4度环境下备用。1.2实验皮肤的完整性考察应用光镜对皮肤进行观察，看其皮肤表面是否有破损。（方法一）用一种已知透皮速率的药物，对皮肤的完整性进行检查试验。（方法二）是否还有更好的完整性考察1.3透皮比较实验将处理好的各种完整的无破损的皮肤取出，角质层面向供给池，真皮层面向接收池，将皮肤夹紧在Franz扩散池，在供给池中加入1ml的丹皮酚溶液作为供给液，接收此中则加入5ml40%的乙醇生理盐水作为接收液，在Franze扩散池进行试验，以透皮速率，皮肤滞留量，累计渗透量，时滞，渗透速率作为指标，对实验数据进行分析，对所选皮肤的相似程度进行比较选择。2、透皮实验各参数的选择筛选出与人体皮肤最为相似的皮肤模型之后，则要对透皮实验时所涉及到的一些试验参数进行考察选择：2、1扩散池转速的确定：预选定四个转速进行试验，100转，120转，200转，,300转分别在透皮两小时后取点，分别取扩散池上方，中部，底部三个位置的点，做液相分析，选择适当的转速。（转速的选择依据）2、2供给液的配制：经查阅相关文献，丹皮酚在外用制剂方面的浓度范围较广，故选择在其区间的100~300μg/ml，梣酮450~600μg/ml，甘草次酸，白鲜碱，苦参碱浓度配制，同时按照良肤乳膏中的药物配比进行各成分的供给液配制。并制备丹皮酚的饱和溶液作为供试浓度之一。2、3接收液的选择：据文献报道，丹皮酚在水中的溶解度在350μg/ml左右，属于略溶物，但是在体外试验中，要在接收池中模拟人体内，药物通过皮肤后会迅速被血管运送到全身的一种“漏槽”模型，故选择双蒸水作为透皮接收液不合适，很容易在实验过程中导致接收此种药物浓度过高或者饱和的现象，影响药物的透过，故选择，生理盐水组，20%PEG400生理盐水，40%PEG400生理盐水，30%乙醇生理盐水，40%乙醇生理盐水，pH6.8磷酸盐缓冲液，pH4.4磷酸盐缓冲液作为比较的接收液种类《以主药溶解性能筛选体外经皮渗透试验中的接收液》2、4各成分的皮肤/生理盐水分配系数的测定精密称取50mg的干燥皮肤样品，取一定量的丹皮酚，梣酮、白鲜碱、甘草次酸生理盐水溶液一起加入安瓿瓶中，密封，于(32士l)℃恒温水浴搅拌24h后，取样，用0.45微孔滤膜保温过滤，进样20μl，按照分析方法测定药物的浓度。各成分在皮肤/生理盐水系统中的分配系数以两相中药物重量浓度的比来表示，其中生理盐水的密度按1.0g/ml计算。计算公式见下式：PC3、皮肤各层的获得：角质层的获得：角质层的获得方法（胶带法——在采样时间点取接收液一定体积，测定在取样点时接收液中的药物含量，同时在各取样后，将皮肤取下，用双蒸水将皮肤表面的药物洗净，并用滤纸将水吸干，下来用胶带在皮肤表面，反复粘扯20次，让后将胶带剪碎置于离心管中，在离心管中加入5ml甲醇，超声震荡10min，放置过夜，再超声振荡10min，将胶带取出，加入甲醇至5ml，将离心管放置于离心机中离心（5000r/min，离心20min）处理。酶解法，将去除真皮的皮肤置于37度蛋白酶溶液（0.0001%朊胰酶及0.5%碳酸钠）中处理24h即可，可使活性表皮的活细胞，获得角质层。表皮的获得：对于大鼠，猪的皮肤而言，可以通过热处理的方法，将皮肤的表皮获得，具体方法如下：将获得的皮肤，洗净，置于65度的热水中45秒——2min，将皮肤取出，用两块玻片将皮肤夹住，皮肤上的残余脂质粘连物会将皮肤粘在下层的玻片上，用手轻轻移动上层的玻片，可以将表皮取下，保存方式与全皮的保存方式一致。去除表皮后，剩余的就是真皮部分。去脂角质层的获得：通常采用酶解法和有机溶剂法（取干燥的角质层，浸没于氯仿一甲醇2:1(v加)溶液中，浸泡24h后取出，挥干有机溶剂，并真空干燥单位重量生理盐水中药物的量单位重量皮肤中药物的量5h，以除去残留溶剂。置于干燥器中保存，备用）。4、良肤乳膏中单一成分的体外透皮实验：4、1丹皮酚的体外透皮特性实验实验前期准备：准备丹皮酚，白鲜碱，梣酮，甘草次酸的供给液，接收液4.1.1丹皮酚的全皮透过实验：选取选定的实验皮肤，用螺旋测微尺测量皮肤的厚度选取一个浓度的丹皮酚溶液作为供结液，平行六份，将所选皮肤全皮置于两个小室之间，夹紧，角质层面向供给池，真皮层面向接收池，在供给池里加入1ml的供给液，在接收池中加入5ml供给液，将全套装置置于Franz扩散池中，温度为（32度+0.5度），转速为所选转速，采样点为所选取采样点，在每次采样时，用移液枪精密移取0.8ml，保证无气泡产生，同时向接收池中加入0.8ml的空白接收液，将移取的接收液置于1.5ml的ep管中，用注射剂吸取，过0.45微米的有机滤头，进行色谱分析。待各点取样结束后，将皮肤取下，用双蒸水洗净表面的药物，用剪刀剪下扩散小室大小的皮肤，并将其剪碎。置于5ml尖头玻璃管中，加入3ml甲醇，超声处理30min，再用甲醇补足刻度，继续超声处理30min，将液体导入离心管中，5000r/min处理10min，取上层液过0.45微米有机滤头，进液相分析。相关数学计算公式：渗透速率的计算式中，p、错误!未找到引用源。、D、错误!未找到引用源。、错误!未找到引用源。分别为药物的渗透系数、药物在皮肤和介质中的分配系数、药物在皮肤内的扩散系数、药物在介质中的溶解度以及皮肤厚度。可见，对于特定的药物，其渗透速率由、D、错误!未找到引用源。、错误!未找到引用源。决定，与药物、介质、皮肤三者的结构、理化性质等有关。累计渗透量的计算公式为有效扩散面积，错误!未找到引用源。为接受液总体积，错误!未找到引用源。为第n次取样时接受液中药物的质量浓度，错误!未找到引用源。为第i次取样时接受液中药物的质量浓度，错误!未找到引用源。为取样体积。以药物的累积透过量错误!未找到引用源。（μg/cm2）对取样时间t作曲线，并对曲线中的直线部分进行线性回归，求出的直线斜率即为稳态透皮速率错误!未找到引用源。（μg/(cm2·h)），直线与x轴的交点为时滞tlag（h），根据下式计算渗透系数错误!未找到引用源。（cm/s）、增渗比ER。药物的皮肤滞留量Qs（μg/cm2）可由下式计算：其中，A为有效扩散面积，V为皮肤提取液总体积，C为皮肤提取液中药物的浓度。在进行单一成分的透皮实验数据处理时，应用的是一次线性方程，对于复方而言，是否一次线性方程仍可以使用就不得而知了，则需要考察。注：每次试验结束时，将皮肤取下，洗净，置于显微镜下观察其结构的形态，拍照留底。然后再将皮肤做滞留量的实验处理。4.1.2丹皮酚的皮肤各层透皮特性实验试验方法同4.1.1，皮肤换作各层皮肤4.1.2.1丹皮酚在表皮的透皮特性实验4.1.2.2丹皮酚在角质层的透皮特性实验4.1.2.3丹皮酚在脱脂角质层的透皮特性实验4.1.2.4丹皮酚在真皮层的透皮特性实验4.2白鲜碱的体外透皮特性实验4.2.1白鲜碱的全皮透过实验4.2.2白鲜碱的皮肤各层透皮特性实验4.2.2.1白鲜碱在表皮的透皮特性实验4.2.2.2白鲜碱在角质层的透皮特性实验4.2.2.3白鲜碱在脱脂角质层的透皮特性实验4.2.2.4白鲜碱在真皮层的透皮特性实验4.3梣酮的体外透皮特性实验4.3.1梣酮的全皮透过实验4.3.2梣酮的皮肤各层透皮特性实验4.3.2.1梣酮在表皮的透皮特性实验4.3.2.2梣酮在角质层的透皮特性实验4.3.2.3梣酮在脱脂角质层的透皮特性实验4.3.2.4梣酮在真皮层的透皮特性实验4.4甘草次酸的体外透皮特性实验4.4.1甘草次酸的全皮透过实验4.4.2甘草次酸的皮肤各层透皮特性实验4.4.2.1甘草次酸在表皮的透皮特性实验4.4.2.2甘草次酸在角质层的透皮特性实验4.4.2.3甘草次酸在脱脂角质层的透皮特性实验4.4.2.4甘草次酸在真皮层的透皮特性实验4、5良肤乳膏的体外透皮实验4.5.1良肤乳膏的全皮透过实验4.5.2良肤乳膏的皮肤各层透皮特性实验（表皮层，角质层，去脂角质层，真皮层）四、良肤乳膏拆方组方后的透皮相关影响的实验研究1、良肤乳膏的拆方、组方方法的设计2、良肤乳膏的成分组方体外透皮实验研究（通过比较单一成分的透皮速率及累计渗透量的变化，反映其相互影响作用）3、相互影响的机理研究（通过偏光镜，DSC来考察）五、中药促渗剂的选择，物理促渗方法的应用试验中药促渗剂初步筛选薄荷醇，冰片，物理促渗方法微针，低频超声