培养基资料2

培养基学习资料1培养基基本概念以及分类1.1.1什么是培养基培养基（Medium）是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。有的培养基还含有抗菌素和色素。因此任何培养基都应具备微生物所需要的六大营养要素，且其间的比例是合适的。任何培养基一旦配成，必须立即进行灭菌，否则很快引起杂菌丛生，并破坏其固有成分和性质。培养基由于配制的原料不同，使用要求不同，而贮存保管方面也稍有不同。一般培养基在受热、吸潮后，易被细菌污染或分解变质，因此一般培养基必须防潮、避光、阴凉处保存。对一些需严格灭菌的培养基（如组织培养基），较长时间的贮存，必须放在2~6度的冰箱内。目前有很多培养基已经商业化生产，而且有些专业机构还提供培养基数据库的查询搜索服务。培养基的选择一般尽可能要满足以下要求：①单位质量基质，应能产生最大量的生物物质或生物化工产品，并且要使所产生的生物物质或生物化工产品在发酵液中的浓度最高，产率最高，使不需要的其他代谢产物的生成，限在最低范围内。②培养基成本低、质量均一并随时保证提供使用。③培养基使用时，对通气、搅拌、后处理和三废治理等方面所产生的问题最少。1.1.2培养基成分培养基的成分包括:碳源、氮源、矿物质,以及其他必需物质。这些成分通过生物反应过程，生成生物物质、生物化工产品，并放出CO2、H2O和热量。培养基的成分还可以由发酵过程中所需的元素出发，如C、H、O、N、S、P、Mg、K等。此外,必要时还有一些需要量很少的微量元素,如Fe、Zn、Cu、Mn、Co、Mo、B等。在发酵过程中某些生物本身不能合成的物质，如氨基酸、维生素或核苷酸等，必要时亦作为营养物质加入到培养基中。碳源具有双重作用。生物在产生生物物质或生物化工产品过程中，它不仅为其提供碳源，也为其提供能源。碳水化合物是微生物发酵中的主要碳源，包括淀粉、葡萄糖、蔗糖和乳糖等。此外，植物油如豆油、棉籽油、玉米油等亦常被应用作为碳源。这类油常与表面活性剂合用，以消除发酵过程中所产生的泡沫。甲醇可用以生产单细胞蛋白。正烷烃类可用以生产有机酸、氨基酸和维生素等，甚至二氧化碳也可作为光合细菌的碳源。氮源包括无机氮源和有机氮源。无机氮源包括氨、铵盐及硝酸盐等，它们在被应用时应注意发酵中pH的变化；有机氮源包括氨基酸、蛋白质及尿素等，有机氮源的加入往往加快了生物的生长。因考虑到成本因素，一些有机氮源，如黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、鱼粉、酵母粉等常被选用。碳、氮源含量不能过高的原因是避免产生基质或产物对反应的抑制和因渗透压过高引起细胞失水而死亡。矿物质培养基中Mg、P、K、S、Ca、Cl常是主要的矿物质的组成成分，其他如Co、Cu、Fe、Mn、Mo及Zn也往往不可少，但需要量很小，可从其他主要培养基成分中得到。如是使用合成培养基就需要把这些微量元素加进去。它们不仅为生物生长所必需，也是为了得到某些产物所必不可少者。例如生物合成青霉素或头孢菌素需要一定量的硫；生物合成维生素B12需要一定量的钴。维生素某些生物在培养过程中需要某些维生素，往往在天然培养基中已经提供了必要的维生素，但在某些特殊情况下需单独加入维生素。例如在谷氨酸生产过程中需加入生物素,某些植物细胞培养中需要硫胺素(维生素B1)。缓冲剂由于发酵过程中pH对形成生物产物的影响很大，为维持稳定的pH，常采用缓冲剂，例如碳酸钙或磷酸盐。后者除能调节pH外，还为培养基提供磷源。前体或代谢调节剂前体是指某一种化合物被加入到发酵培养基中之后，能直接参与产物的生物合成中去。如在青霉素G（即苄基青霉素）的发酵过程中,加入适当的苄基化合物（如苯乙酸）能明显提高青霉素G的产量。代谢调节剂中包括抑制剂和诱导剂，当一种抑制剂加入到发酵过程中时能抑制不需要的产物，而大量产生所需的特定产物（或中间体）。如在四环素发酵中，加入溴化物能抑制金霉素(即氯四环素)的形成，从而增加四环素的产量。至于诱导剂，多数酶的生成需要它来诱导。在正常情况下,酶所需的基质或基质的类似物,可用作诱导剂。如曲霉产生α－淀粉酶时需要淀粉作诱导剂。防沫剂也称消泡剂，一种表面活性剂，能降低泡沫的表面张力，从而消除发酵中泡沫。在多数好气发酵中需解决泡沫问题。泡沫形成的主要原因是由于在培养基中有蛋白质，从而在发酵液和空气泡之间的界面上形成膜，这种膜不易被破坏。泡沫大量形成后，能进入发酵罐的排气管道而造成发酵染菌及发酵液流失。常用的消泡剂为油脂类、酯类、硅油及聚氧乙烯－聚氧丙烯甘油醚。加入消泡剂能降低氧传递率达50％，因此消泡剂应尽量少加。动物细胞的培养基，包括葡萄糖（有时加半乳糖）、氨基酸（有时加蛋白水解液）、维生素、激素、无机盐及血清等,其中血清常是必要的，且含量要占5％～10％。由于它的来源有限，价格高昂，因此正在进行无血清培养的研究。植物细胞的培养基，除了包括微生物培养基的基本成分外，还必须包含植物激素（如生长素、细胞分裂素等）、植物生长调节剂(人工合成的外源激素)及必要的前体。1.2培养基分类由于各种所需要的营养不同，所以培养基的种类很多。据估计目前约有数千种不同的培养基，这些培养基可根据所含成分、物理状态、以及不同的使用目的等而分成若干类型。1.2.1按照培养基的成分来分培养基按其所含成分，可分为合成培养基、天然培养基和半合成培养基三类。(1)合成培养基。合成培养基的各种成分完全是已知的各种化学物质。这种培养基的化学成分清楚，组成成分精确，重复性强，但价格较贵，而且微生物在这类培养基中生长较慢。如高氏一号合成培养基、察氏（Czapek）培养基等。(2)天然培养基。由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤，前者用于培养霉菌，后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，所以常被采用。(3)半合成培养基。在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分，如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。这类培养基能更有效地满足微生物对营养物质的需要。1.2.2按照培养基的物理状态分培养基按其物理状态可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基三类。(1)固体培养基。是在培养基中加入凝固剂，有琼脂、明胶、硅胶等。固体培养基常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存等方面。(2)液体培养基。液体培养基中不加任何凝固剂。这种培养基的成分均匀，微生物能充分接触和利用培养基中的养料，适于作生理等研究，由于发酵率高，操作方便，也常用于发酵工业。(3)半固体培养基。是在液体培养基中加入少量凝固剂而呈半固体状态。可用于观察细菌的运动、鉴定菌种和测定噬菌体的效价等方面。1.2.3按照微生物的种类分培养基按微生物的种类可分为细菌培养基、放线菌培养基、酵母菌培养基和霉菌培养基等四类。常用的细菌培养基有营养肉汤和营养琼脂培养基；常用的放线菌培养基为高氏1号培养基；常用的酵母菌培养基有马铃薯蔗糖培养基和麦芽汁培养基；常用的霉菌培养基有马铃薯蔗糖培养基、豆芽汁葡萄糖（或蔗糖）琼脂培养基和察氏培养基等。1.2.4.按照培养基用途分培养基按其特殊用途可分为加富培养基、选择性培养基和鉴别培养基。(1)加富培养基。是在培养基中加入血、血清、动植物组织提取液，用以培养要求比较苛刻的某些微生物。(2)选择性培养基。是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。(3)鉴别培养基。是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使培养后会发生某种变化，从而区别不同类型的微生物。另外根据生产上用途的不同培养基又可分为：孢子培养基、种子培养基和发酵培养基三种。在生产的不同阶段，由于所要达到的目标不同，具体成分也不尽相同。针对VB2，我们的所进行配方调整主要是对种子罐培养基和发酵罐培养基的调整与优化。种子培养基的营养成分要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也要高些，但总浓度以略稀薄为好，这样可达到较高的溶解氧，供大量菌体生长繁殖。种子培养基的成分要考虑在微生物代谢过程中能维持稳定的pH，其组成还要根据不同菌种的生理特征而定。一般种子培养基都用营养丰富而完全的天然有机氮源。但无机氮源容易利用，有利于菌体迅速生长，所以在种子培养基中常包括有机及无机氮源。最后一级的种子培养基的成分最好能较接近发酵培养基，这样可使种子进入发酵培养基后能迅速适应，快速生长。发酵培养基发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成需产物。因此，发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。但若因生长和生物合成产物需要的总的碳源、氮源、磷源等的浓度太高，或生长和合成两阶段各需的最佳条件要求不同时，则可考虑培养基用分批补料来加以满足。2配方调整的基本要求与原则2.1为什么要进行培养基优化对于微生物的生长及发酵，其培养基成份非常复杂，特别是有关微生物发酵的培养基，各营养物质和生长因子之间的配比，以及它们之间的相互作用是非常微妙的。面对特定的微生物，人们希望找到一种最适合其生长及发酵的培养基，在原来的基础上提高发酵产物的产量，以期达到生产最大发酵产物的目的。发酵培养基的优化在微生物产业化生产中举足轻重，是从实验室到工业生产的必要环节。能否设计出一个好的发酵培养基，是一个发酵产品工业化成功中非常重要的一步[2]。以工业微生物为例，选育或构建一株优良菌株仅仅是一个开始，要使优良菌株的潜力充分发挥出来，还必须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度（便于下游处理），较高的底物转化率（降低原料成本）和较高的生产强度（缩短发酵周期）。设计发酵培养基时还应时刻把工业应用的目的留在脑海里。2.2基本注意点培养基成分和配比的选择培养基的组分（包括这些组分的来源和加工方法）、配比、缓冲能力，粘度，消毒是否易彻底，消毒后营养破坏程度，及原料中杂质的含量都对菌体的生长和产物形成有影响。但目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方。目前还只能是在生物化学、细胞生物学等的基本理论指导下，参照前人所使用的较适合于某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，对碳源、氮源、无机盐和前体等进行逐个单因子试验，观察这些因子对菌体生长和产物合成量的影响。最后再综合考虑各因素的影响，得到一个比较适合本菌种的生产配方，以求得到高产。为了加快试验时间，可考虑用“正交试验设计”等数学方法来确定培养基组分和浓度，它可以通过比较少的实验次数而得到较满意的结果。另外还可通过方差分析，了解哪个因素影响较大，以引起人们的注意。在考虑培养基总体要求时，要注意一些问题。第一，考虑碳源、氮源时，要注意快速利用的碳（氮）源和慢速利用的碳（氮）源的相互配合，发挥各自的优势，避其所短。第二，选用适当的碳氮比。培养基中氮比的影响极为明显。氮源过多，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少，从而影响产量，碳源过多，则容易形成较低的pH，若碳源不足，易引起菌体衰老和自溶。另外碳氮比不当还会影响菌体按比例地吸收营养物质，直接影响菌体的生长和产物的形成。菌体在不同的生长阶段，其对碳氮比的最适要求也不一样。一般碳源因为既作碳架又作能源，因此用量要比氮多。一般工业发酵培养基的碳氮比约为100：0.2－2.0；但碳氮比随碳水化合物及氮源的种类以及通气搅拌等条件而异，很难确定一个统一的比值。第三，要注意生理酸、碱性盐和pH缓冲剂的加入和搭配。这是根据该菌种在现有工艺设备条件下，其生长合成产物时pH变化情况，以及最适pH控制范围等，综合考虑选用什么生理酸碱性物质及其用量，从而保证在整个发酵过程中pH都能维持在最佳状态（有时也可考虑用中间补料来控制pH）。培养基成分的用量的多少，大部分是根据经验而来。但有些主要代谢的产物因为它们的代谢途径比较清楚，所以可以根据物料平衡计算来加以确定。在确定培养基