基因定点突变技术简介-sill

基因定点突变技术简介：一般来说，基因突变是不定向的，是随机的，且突变频率非常低。而通过定点突变技术，可以按照预定设计，对某个已知基因的特定碱基进行定点增删或转换，最终改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，因此基因定点突变技术是蛋白质工程研究中的重要工具。基因定点突变主要有以下三种方法：1.寡核苷酸介导的定点突变该方法以M13噬菌体的DNA为载体，在操作时，首先利用转基因技术，将待诱变的目的基因插入到M13噬菌体的正链DNA上，制备含有目的基因的单链DNA。再使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，启动单链DNA分子进行复制，这段寡核苷酸引物便成为新合成的DNA子链的一个组成部分，将其转入细胞后，经过不断复制，可获得突变的DNA分子。Stratagene公司研制了QuikChangeLightningSite-DirectedMutagenesisKit即是在此种方法上进行改良的：以含目的DNA的质粒为模板，在要突变处设计一对反向互补的引物，用高保真酶进行扩增，再用dpnI消化掉质粒模板，将已经形成环状的PCR产物转化进大肠杆菌就可以。2．盒式定点突变该方法是利用一段人工合成的含有突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中相应序列。这种突变的寡核苷酸是由两条寡核苷酸组成的，当其退火时，按设计要求产生克隆需要的黏性末端。由于不存在异源双链的中间体，因此重组质粒全部是突变体。但这种方法需要在靶DNA区段的两侧存在一对限制酶单切点，限制了该方法的使用。3.PCR介导的定点突变经典PCR介导的定点突变法，需要4种扩增引物，进行3次PCR反应(见图2)。头两次PCR反应中，应用两个互补的并在相同部位具有相同碱基突变的内侧引物，扩增形成两条有一端可彼此重叠的双链DNA片段，去除未参入的多余引物之后，这两条双链DNA片段经变性和退火可以形成具有3’凹末端的异源双链分子，在TaqDNA聚合酶的作用下，产生含重叠序列的双链DNA分子。这种DNA分子再用两个外侧寡核苷酸引物进行第三次PCR扩增，便产生突变体DNA。