基因工程原理及实验的考试重点

一.基因工程的概念：1.限制性内切酶:识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键，在特定部位限制性地切割DNA分子。2.Southern杂交:将带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。3.Northern杂交:是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。4.反义RNA技术:反义RNA是指与靶RNA具有互补序列的RNA分子,它通过与靶RNA进行碱基配对结合调节结构基因的表达。二.需要了解的简单知识1.限制性内切酶的分类Ⅰ型限制性内切酶：多聚体蛋白质，具有切割DNA的功能，作用时需要ATP、Mg2+和S-腺苷蛋氨酸的存在。切割DNA的方式是，先与双链DNA上未加修饰的识别序列相互作用，然后沿着DNA分子移动，在行进相当于1000~5000个核苷酸的距离之后在随机位置上切割单链DNA。Ⅱ型限制性内切酶：分子量较小的单体蛋白，作用时仅需要Mg2+存在即可维持活性，它可在特殊位点切割DNA，产生具有黏性末端或其他形式的DNA分子片段。Ⅲ型限制性内切酶：是一些具有独特的识别方式和切割方法的内切酶。2.基因工程工具酶种类及其功能限制性核酸内切酶切割DNADNA连接酶生成3′-5′磷酸二酯键DNA聚合酶Ⅰ探针标记、补平3′末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探针标记末端转移酶3′末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基3.PCR技术原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①
板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②
模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③
引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的模板DNA链。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。4.基因工程在食品产业中的应用（1）利用基因工程改造食品微生物1.改良微生物菌种2.改良乳酸菌遗传特性3.酶制剂的生产（2）利用基因工程改善食品原料的品质1.改良动物食品性状2.改造植物性食品原料（3）利用基因工程改进食品生产工艺1.利用DNA重组技术改进果糖和乙醇生产方法2.改良啤酒大麦的加工工艺3.改良小麦种子贮藏蛋白的烘烤特性4.改善牛乳加工特性（4）利用基因工程生产食品添加剂及功能性食品1.生产氨基酸2.生产黄原胶3.超氧化物歧化酶（SOD）的基因工程4.应用于生产保健食品的有效成分5.基因工程的操作步骤(1)目的基因的获得与序列分析(2)目的基因与载体的连接（重组与克隆）(3)重组DNA向受体的转化(4)植物细胞转化技术(5)重组体的筛选与外源基因的鉴定6.反义基因技术的特点反义技术具有明显的优点：（1）反义核苷酸是针对特定的靶mRNA（DNA）的序列设计合成，具有极高的特异性，不影响其他基因的表达；（2）反义核酸是针对已知序列的靶基因设计合成的，由于靶基因序列已知，反义核酸仅有15-30个碱基，结构简单，容易设计和体外大量合成。（3）反义基因不必了解其目的基因所编码的蛋白质结构，可省去对基因产物的研究工作。（4）反义基因进入细胞内与细胞周期无关，既可进入增殖期细胞又可进入非增殖期细胞。（5）反义基因整合到植物的基因组中可独立表达和稳定遗传，类似于遗传上的缺陷型，表现为显性，后代符合孟德尔遗传规律。（6）反义寡核苷酸不含病毒序列，不会产生免疫反应，也不会整合入宿主染色体内。（7）反义基因不改变目的基因的结构，在应用上更加安全。反义技术的缺点：（1）反义基因有毒副作用（2）反义基因的半衰期短；（3）反义基因的转移与吸收效率不高。尤其是局部腔内转移系统，靶组织吸收反义核酸的效率比较低，影响其作用效果；（4）在临床上，靶基因的选择，反义基因的最佳应用剂量和最佳作用时间不好把握，7.理想基因工程载体应具备哪些特征？(1)能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制。在外源DNA插入其DNA之后，仍能保持稳定的复制状态和遗传特性。(2)易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。(3)在其DNA序列中有适当的限制性内切酶单一切位点。这些位点位于DNA复制的非必需区内，可以在这些位点上插入外源DNA，但不影响载体自身DNA的复制。(4)具有能够直接观察的表型特征（有报告基因），在插入外源DNA后，这些特征可以作为重组DNA选择的标志。8.目前常用的基因载体有哪几种？目前常用的基因载体有细菌质粒载体、农杆菌质粒载体、λ噬菌体载体、柯氏质粒载体和病毒载体等。9.目的基因的获得方法有哪些？(1)鸟枪法:利用“散弹射击”原理去“命中”某个基因。(2)物理化学法:物理化学法分离基因，就是利用核酸DNA双螺旋之间存在着碱基G和C配对、A和T配对的这一特性，从生物基因组分离目的基因的方法。常用的主要方法有：1密度梯度离心法；2单链酶法；3分子杂交法。(3)化学合成法(4)酶促逆转录合成法(5)PCR扩增法讨论：1.基因工程的前景展望基因工程运用DNA分子重组技术，能够按照人们预先的设计创造出许多新的遗传结合体，具有新奇遗传性状的新型产物，增强了人们改造动植物的主观能动性、预见性。而且在人类疾病的诊断、治疗等方面具有革命性的推动作用，对人口素质、环境保护等作出巨大贡献。所以，各国政府及一些大公司都十分重视基因工程技术的研究与开发应用，抢夺这一高科技制高点。其应用前景十分广阔。我国基因工程技术尚落后于发达国家，更应当加速发展，切不可坐失良机。但是，任何科学技术都是一把“双刃剑”，在给人类带来利益的同时，也会给人类带来一定的灾难。比如基因药物，它不仅能根治遗传性疾病、恶性肿瘤、心脑血管疾病等，甚至人的智力、体魄、性格、外表等亦可随意加以改造；还有，克隆技术如果不加限制，任其自由发展，最终有可能导致人类的毁灭。还有，尽管目前的转基因动植物还未发现对人类有什么危害，但不等于说转基因动植物就是十分安全的，毕竟这些东西还是新生事物，需要实践慢慢地检验。转基因生物和常规繁殖生长的品种一样，是在原有品种的基础上对其部分性状进行修饰或增加新性状，或消除原来的不利性状，但常规育种是通过自然选择，而且是近缘杂交，适者生存下来，不适者被淘汰掉。而转基因生物远远超出了近缘的范围，人们对可能出现的新组合、新性状会不会影响人类健康和环境，还缺乏知识和经验，按目前的科学水平还不能完全精确地预测。所以，我们要在抓住机遇，大力发展基因工程技术的同时，需要严格管理，充分重视转基因生物的安全性。2.反义基因技术的概念、原理和特点，以番茄为例介绍培育过程。（1）反义基因技术是将能抑制目的基因表达的一段反义寡核苷酸，导入细胞中，抑制或封闭该基因的表达或者造成新的突变表型，人为控制基因表达的技术方法。（2）原理是：导入细胞的反义基因，可以通过碱基互补原理，干扰靶基因的解旋、复制、转录、mRNA的剪接加工乃至输出和翻译等各个环节，达到封闭该基因的表达或者造成新的突变表型，从而调节细胞的生长、分化等。反义技术具有明显的优点：（1）反义核苷酸是针对特定的靶mRNA（DNA）的序列设计合成，具有极高的特异性，不影响其他基因的表达；（2）反义核酸是针对已知序列的靶基因设计合成的，由于靶基因序列已知，反义核酸仅有15-30个碱基，结构简单，容易设计和体外大量合成。（3）反义基因不必了解其目的基因所编码的蛋白质结构，可省去对基因产物的研究工作。（4）反义基因进入细胞内与细胞周期无关，既可进入增殖期细胞又可进入非增殖期细胞。（5）反义基因整合到植物的基因组中可独立表达和稳定遗传，类似于遗传上的缺陷型，表现为显性，后代符合孟德尔遗传规律。（6）反义寡核苷酸不含病毒序列，不会产生免疫反应，也不会整合入宿主染色体内。（7）反义基因不改变目的基因的结构，在应用上更加安全。反义技术的缺点：（1）反义基因有毒副作用反义基因的细胞毒副作用与核酸的化学修饰基因、序列长度及作用浓度和时间有关。反义核苷酸可在心、胃、肠等脏器中明显聚集，这些非靶器官中集聚的反义核酸可产生非特异性地蛋白合成抑制作用，尤其是对骨髓和小肠等增生旺盛的器官；同时寡核苷酸降解后剩余的化学修饰碱基有掺合入DNA而引起突变或干扰DNA修复的可能。局部应用反义基因可明显减少其对远处组织的毒副作用。（2）反义基因的半衰期短；（3）反义基因的转移与吸收效率不高。尤其是局部腔内转移系统，靶组织吸收反义核酸的效率比较低，影响其作用效果；（4）在临床上，靶基因的选择，反义基因的最佳应用剂量和最佳作用时间不好把握，以番茄为例介绍培育过程：多聚半乳糖醛酸酶基因:简称PG，利用转基因技术得到的反义PG番茄具有许多明显的经济价值。如果实采后贮藏期可延长1倍等。乙烯合成相关酶基因:如导入反义ACC合成酶基因；导入反义ACC氧化酶基因；导入正义细菌ACC脱氧酶基因；导入正义噬菌体SAM水解酶基因。ACC合成酶基因:ACC合成酶是乙烯生物合成的关键酶，由一个多基因家族所编码，同时，ACC合成酶有许多同工酶，酶活性和生物合成受多种因素调控。ACC氧化酶基因:ACC氧化酶又叫乙烯形成酶，也是乙烯合成途径中的关键酶。1、得到目的基因PG；2、构建反义PG基因重组子；3、利用携带反义PG基因的农杆菌Ti质粒，通过叶盘法进行转化番茄子叶或者下胚轴。4、被转化的番茄子叶或者下胚轴在含有一定浓度的抗生素培养基上培养，经历愈伤组织形成、发芽、生根等过程，逐渐形成一颗完整植株。5、对再生植株进行鉴定，检测外源基因是否已经转录、翻译和表达等。6、对正确表达目的基因的植株进行选育，获得纯合体后代，通过安全评价程序，进行田间释放、中试和商业化生产。