基因工程原理第10章动物细胞的基因转移.

动物细胞的基因转移1Introduction•动物细胞的基因转移已应用了40多年•研究基因功能和调控或者生产大量的重组蛋白•哺乳动物细胞系，杆状病毒表达系统•体内基因治疗•不同于转基因动物2动物细胞基因转移的策略•直接DNA转移显微注射，基因枪•转染技术利用化学和物理技术诱导细胞从外界环境摄取DNA•病毒介导——转导•细菌介导——细菌感染3转染技术•化学方法（不同的方法有相似的原理）DNA/磷酸钙共沉淀法其他化学方法脂质体转染•物理方法（有多样的机制）电穿孔，显微注射，基因枪4DNA/磷酸钙共沉淀法•HPRT缺陷型的细胞•DNA/磷酸钙共沉淀为复合物，积累到细胞膜上，然后再由细胞摄取到内部，并转运到细胞核，DNA释放并得到表达•沉淀物要现用现配•沉淀物必须包裹细胞，只适用于单层生长的细胞，而不适用悬浮或成团生长的细胞•转染效率低56其他的化学转染方法•二乙氨乙基葡聚糖(DEAE-dextran)可溶性聚阳离子糖类，可以促进DNA与胞吞相互作用•瞬时转染效率很高，但不能形成稳定转化的细胞系7脂质体转染Lipofection(liposometransfection)•将DNA包装到一个磷脂泡囊中，泡囊可以与靶细胞的细胞膜相互作用，促进DNA摄取。•适用于多种细胞类型，包括悬浮细胞•可以转染大片段DNA，比较温和•转染效率高达90%•可用于基因治疗89Lipofection10电穿孔法•细胞置于短暂的电脉冲中使细胞膜上形成瞬时的纳米大小的孔，DNA通过这些孔进入细胞并转运到核。•适用于多种类型的细胞•确定电脉冲的强度和持续时间•参数确定后，具有高重复性•需要的细胞量比较大，容易引起死亡11单细胞转染新技术：纳米钢笔探针电穿孔12直接转化的方法•显微注射1314•基因枪瞬时转染和稳定转染•瞬时转染：转入的DNA不能被细胞所整合，DNA在核中保持外源染色体状态，也不包含在宿主细胞中可以发挥功能的复制起始位点，那么它只能保留很短的时间就会稀释或者降解。•稳定转染：DNA整合到基因组中，形成新的遗传位点，并遗传给所有的无性繁殖后代。15共转染和稳定转染的筛选动物细胞的选择标记•内源选择标记（依赖突变体）•共转染•显性选择标记16TK可用作内源选择标记17常用的内源选择标记基因共转染•物理上不相连的DNA进行转染，都会整合到基因组中。•利用了解清楚的质粒与目的基因共转染，已知的筛选标记筛选，Southern鉴定目的基因。•不相连的供体DNA片段在整合之前发生了融合。19显性选择标记•内源标记的缺陷：只能用于那些对应基因不具有功能的突变细胞系。•显性选择标记所提供的表现型对于细胞来说是全新的，因此可以用于任何类型的细胞。2021选择标记和转化基因的扩增•添加药物筛选后，少数个别细胞会自发产生抗药性突变而存活•氨甲喋呤，DHFR，dhfr•“假阳性”的去除：强启动子驱动dhfr，引入第二个选择标记22DNA介导的基因转移质粒载体23质粒载体进行转染的优点•质粒载体的方便性得以在动物细胞中应用•质粒上的调控序列可以驱动目的基因的表达•质粒上的选择标记和目的基因会一起整合到基因组，不需要与其他基因共转染•穿梭载体的使用，使载体保持为游离的复制子24用于瞬时转化的非复制型质粒载体•瞬时转化时经常使用质粒载体•目的就是利用染色体外DNA的短期存在性•基因表达的瞬时测定和重组蛋白的适量回收•在大多数动物细胞中共价闭合环状DNA只能保持1~2天。25复制子载体的转染•失控的多瘤病毒复制子•BK和BPV复制子的稳定转化•EBV复制子的稳定转化26失控的多瘤病毒复制子•多瘤病毒会造成溶解感染，即病毒基因组复制出非常高的拷贝数，从而使细胞裂解，释放出成千上万的子代病毒颗粒。•利用其复制起点和启动子构建克隆载体，瞬时转染，大量生产重组蛋白27SV40病毒载体•SV40有约5kb的环状双链DNA基因组•最初的SV40载体是病毒载体•病毒外壳最大只能插入2.5kb的外源DNA28SV40质粒载体•携带有SV40复制起点的质粒与病毒本身具有同样的作用•将SV40复制起点克隆到大肠杆菌载体上•T抗原编码区•整合鼠多瘤病毒复制起始位点•人巨细胞病毒启动子29BK和BPV复制子的稳定转染•BK病毒和EBV病毒会导致潜伏性感染，病毒基因组保持在低或中等的拷贝数，从而不会影响宿主细胞的生长。•稳定转染效率等于普通瞬时转染的效率•提供BKT抗原后，含有BK复制起点的质粒载体就会像病毒一样进行复制•引入neo等选择标记后，逐步提高培养基中抗生素的浓度，就可以筛选高拷贝的细胞3031BPV载体32EBP载体33腺病毒•DNA病毒，基因组大约36kb•6个早期转录子，1个主要的后期转录子•稳定性、外源DNA高容量、宿主范围广、高滴度后代34腺病毒相关载体AAV•单链DNA病毒•对异源辅助病毒有依赖性•AAV载体已用于将基因高效转入许多类型的细胞35杆状病毒•杆状病毒具有杆状的衣壳和大的dsDNA基因组•感染许多节肢动物，特别是昆虫。•主要用于在昆虫和昆虫细胞内的高水平瞬时蛋白表达•AcMNPV和BmNPV•sf9，sf21家蚕活体36373839动物细胞中高水平表达外源基因的载体设计•强组成型启动子的使用•包含内含子•包含polyA•去掉冗余的非翻译序列•提高外源基因翻译效率•整合一个靶信号4041