基因工程复习要点

一名词解释：1基因：是遗传信息的基本单位，携带着某种蛋白质或RNA的遗传信息。从化学本质上看，基因是一段携带特定遗传信息的脱氧核糖核苷酸(DNA)序列，是构成巨大遗传单位染色体的组成部分。2基因工程：按照人们的愿望，进行严密的设计，利用体外DNA重组和转基因等生物技术，有目的地改造生物性状使之具有满足人们特定需求的能力。最突出的优点：打破了常规育种难以突破的物种之间的界限，使不同的物种之间可以进行遗传信息的重组和转移。3Tm：熔点温度或者解链温度，是DNA变性进行到一半时的温度4同裂酶：有时，一些限制性内切酶虽然来源不同，但是识别序列相同，这样的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。此种酶切割位点可同可不同。5PCR技术：是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，即聚合酶链式反应技术。（已知的短片段1kb以内）6质粒不相容性：不同质粒有的可共存于同一细胞中，但有的不行。不能同寓于一个细胞中的不同质粒称为不相容性质粒。7转录单元：始于启动子，止于终止子，中间是一段转录区，转录为单链RNA的一段序列8杂种位点：hybridsite：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。9基因表达：基因通过DNA的转录和RNA的转译等过程，将其所携带的遗传信息转变成蛋白质(或RNA转录本)的过程。10基因组文库：某一特定生物的很多克隆的集合，其中克隆数足够大以覆盖每一个基因。11ORF：开放阅读框，以起始密码子开始终止密码子结束的一串三联体核苷酸序列。起始密码子：ATG终止密码子：TAATACTGA12克隆：动词：是指从一个共同祖先经无性繁殖得到的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊生命群体；名词：指从同一个祖先产生这类同一的DNA分子群体、细胞群体或个体群体的过程。13蛋白质印迹杂交技术：将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。14同尾酶：isocaudamer指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。二选择题：1焦磷酸测序中没用到以下什么酶；（dna聚合酶(DNApolymerase)、ATP硫酸化酶(ATPsulfurytase).荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶都有）2克隆基因常用强效载体，哪种不适用于大肠杆菌，选Gal；3质粒克隆载体非必需元件，选融合标签；4外源基因在下列哪种中表达最完善（哺乳动物细胞）；5一个完整的转录单位不包括（复制起始位点）。三简答题：1简要勾勒一副原核表达载体图。（重点是要包括原核表达载体的６个要素：启动子、核糖体结合位点、多克隆位点、转录终止子、抗性筛选基因、复制起始点。）2以EcoRI为例说明限制性核酸内切酶的命名原则：一般以提取这类酶的生物属名头一个字母和种名的头两个字母以及菌株（型）的代号来命名。第一个字母：大写并斜写，表示所来自微生物的属名的第一个字母。第二、三字母：小写并斜写，表示所来自微生物种名的第一、二个字母。其它字母：大写或小写，表示所来自微生物的菌株号；罗马数字：表示在该菌株发现的限制酶的编号。例：EcoRI:来自于EscheriacoliRY13的第一种限制酶。3.简述α-互补法筛选重组克隆子的原理：噬菌体载体的基因间隔区插入E.coli的一段调节基因及lacZ的N端146个氨基酸残基编码基因，其编码产物为β—半乳糖苷酶的α片段。突变型lac-E.coli可表达该酶的W片段（酶的C端）。单独存在的α及W片段均无β半乳糖苷酶活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两片段时，宿主细胞内才有β半乳糖苷酶活性，使特异性作用物变为蓝色化合物。4.简要比较大肠杆菌表达系统和几种常用的真核细胞表达系统的优缺点：1.大肠杆菌：最早用于表达外源基因的宿主细胞优点：具有遗传背景清楚、操作简单、表达效率高、易于纯化等优点；缺点：缺乏折叠复性系统、无翻译后加工和修饰系统、内源蛋白酶作用。2.哺乳动物细胞和昆虫细胞：优点：能够正确折叠、翻译后加工和修饰系统完善，能够表达各种哺乳类细胞蛋白；缺点：这些表达系统往往操作比较复杂，表达水平低，不易推广使用。3.酵母细胞优点：作为单细胞生物，能够像细菌一样在廉价的培养基上快速生长，能方便地操作外源基因。能对翻译的蛋白进行加工和修饰，如二硫键的正确形成、前体蛋白的水解加工，表达产物与天然蛋白相同或相似。可将外源基因与N-末端前导肽等信号肽融合，指导新生肽的分泌，并对分泌蛋白进行糖基化修饰。可采用MOX、AOX、lac4等高表达的强启动子，并可诱导表达。可移去起始甲硫氨酸，避免了作为药物使用可能引起的免疫反应问题。缺点及改进措施：表达外源基因时，遗传和翻译的稳定性常受影响，如点突变，可通过高拷贝基因来解决。翻译产物不稳定，可利用液泡蛋白酶缺陷型来解决。选择翻译后具有修饰能力的酵母以及合适的载体。分泌表达时前导肽去除不够完全，可加入间隔序列肽。糖基化以甘露糖型为主，而且易过度糖基化，可改变宿主糖基化背景。5.简述用于基因工程中DNA分子改造的四类工具酶及其作用，并举例说明：1.核酸酶：通过断裂相邻DNA链核苷酸之间的磷酸二酯键而降解DNA分子。切割、缩短、或降解核酸分子，有核酸外切酶和核酸内切酶2.连接酶：催化相邻核苷酸的游离5'-磷酸基团和3'-羟基形成二酯键的酶。连接核酸分子3.聚合酶：催化以核酸链为模板合成新核酸链的酶。包括DNA聚合酶和RNA聚合酶。复制核酸分子4.修饰酶：能催化稀有碱基参入RNA或DNA，或对原有碱基进行修饰的酶，以防止限制性内切酶的破坏。去除或添加化学基团6.重组克隆载体构建策略：目的基因片段被插入到载体中，生成一个嵌合体或称作重组DNA分子；载体作为一个运输工具将目的基因转运到一个宿主细胞中；在宿主细胞中载体复制产生大量同一拷贝，同时也使目的基因得到扩增；宿主细胞增殖时，重组DNA分子的拷贝转移到子细胞中，随着载体进行进一步复制；细胞多次分裂后，一个由相同细胞组成的细胞群体，或称作一个克隆被生产出来，每一个细胞都包含一个或多个重组DNA分子的拷贝，此时重组分子所携带的目的基因就被克隆了。7.基因工程技术路线：通过基因文库筛选、PCR扩增或人工化学合成等手段获得目的基因；构建所需基因载体；目的基因与载体在体外重组后导入受体细胞，进行增值或表达等。基因工程一般包括四个步骤，也即技术路线：一、取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二、构建基因的表达载体；三、将目的基因导入受体细胞；四、目的基因的检测与鉴定。8.cdna文库的建立：cDNA文库是指某生物某一特定的发育时期、特定的组织或器官所转录的mRNA形成的cDNA片段与载体连接而形成的克隆的集合。cDNA文库是有时效性的，cDNA文库只反映mRNA的分子结构。文库构建基本程序：①分离提取含有目的基因的组织细胞的总RNA或者总mRNA；②cDNA的第一链的合成；③cDNA的第二链的合成；④将cDNA双链重组到载体上9简述链终止法测序原理：聚丙烯酰胺凝胶电泳可以将长度上相差一个核苷酸碱基的单链DNA分子相互分离开来。10简述PCR产物克隆过程：①特殊的克隆载体（T载体）；②设计含限制性酶切位点的引物。四论述题：1.根据自己所掌握的基因工程方面的知识，谈谈IPTG诱导目的基因在pET载体表达系统中高效表达的原理：1)噬菌体DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)是最常用的表达菌株，噬菌体DE3是λ噬菌体的衍生株，构建好的表达载体可以直接转入表达菌株中，诱导蛋白的表达方式与lac启动子一样都是iptg诱导。2)表达菌株BL21(DE3)上带有lacI基因，T7RNA聚合酶编码基因以及lacUV5启动子，lacUV5启动子可以启动T7RNA聚合酶的表达;3)表达质粒如pET-28质粒带有T7启动子和编码阻遏蛋白lacI的基因，在插入目的基因后，lacI是失活的;4)在非诱导条件下，表达菌株中表达出的lacI阻遏蛋白可以作用于T7RNA聚合酶前的lacUV5启动子，从而抑制T7RNA聚合酶的表达。IPTG是乳糖类似物，可以与阻遏蛋白lacI结合，使其对lacUV5启动子失去阻遏作用，T7RNA聚合酶得以合成，继而与pET-28质粒上的T7启动子结合，启动下游基因包括目的基因的表达，从而产生目的蛋白。2.pcr产物的克隆方法：黏性末端连接，将PCR产物回收后，利用引物中附加在5’端的限制酶切位点，可直接用相应的限制性内切核酸酶酶切后产生黏性末端，与载体连接，产生重组DNA；产物尾部加dT或ddT，TaqDNA聚合酶会在3'端加上多余的非模板依赖碱基,而且对A优先聚合,所以PCR产物末端的多余碱基大部分都是A.。利用这一特点,可以经限制酶切割产生的平末端用酶加上dT或ddT,使载体与PCR产物末端互补并进行连接.载体末端加dT尾可直接用TaqDNA聚合酶和dTTP或ddTTP,ddTTP因缺少3-OH而不能再形成磷酸二酯键,保证在载体3'端只加上一个ddTTP,而其5'端所含的磷酸基团可与PCR产物的3'端OH连接,连接产物在载体和PCR产物之间的双链上带两个切口,这种重组DNA仍可转化合适的受体菌,并在细菌体内修复；平末端连接，由于TaqDNA聚合酶能在PCR产物3’端加上非模板依赖的多余碱基，因此可用T4DNA聚合酶处理补平末端，然后用平末端连接克隆PCR产物。3.题目很长。。。主要就是设计实验方案，包括整套基因工程的具体流程到最后在dna、rna、蛋白质水平鉴定表达产物和产物活性的鉴定：基因工程基本操作：目的基因的获取（从基因文库，利用PCR技术，人工合成），基因表达载体的构建（目的基因，启动子，终止子，标记基因），将目的基因导入受体细胞（显微注射法，基因枪法，农杆菌转化法），目的基因的检测与鉴定（分子水平的检测——目的基因是否插入，转录，翻译，个体水平的检测）1PCR实验的基本步骤：模板DNA变性：反应混合物加热到94℃，双链DNA分子解链；引物退火：变性后，将温度降低到55℃左右，从而使引物模板DNA特异性互补配对；延伸：升温到72℃，TaqDNA聚合酶结合到引物3’端，合成与模板DNA互补的新链。重复循环。2为什么基因克隆和PCR如此重要：这两种技术都能够将目的基因从细胞的所有其他基因中分离出来，获得纯的单一基因样品。3PCR与基因克隆技术的比较：一个PCR可以在数小时内完成一个基因克隆可能要花几周甚至几个月因而，PCR技术比基因克隆要方便快捷的多。PCR技术的局限性：仅用于已知序列的基因扩增，不适用于未知序列的基因扩增。PCR扩增产物长度有限。因而，基因克隆是分离长片段基因或者以前从未研究过的基因的唯一方法。4Cos位点的作用：环化作用，提供特异性酶切位点；CTAB：十六烷基三甲基溴化铵，一种去垢剂，能与核酸一起形成不溶物。异硫氰酸胍：一种强离序盐，能使除核酸外的所有生化成分变性和溶解，使DNA牢固地吸附在二氧化硅颗粒上。