基因工程技术

仪器使用注意事项移液枪的使用：第一步：调节刻度至合适的体积严格的精确调节方法：从大量程调至小量程，精度最佳，从小量程调节至大量程，最好先调至大一点，再返回。第二步：装配枪头：轻取吸头，左右转动第三步：吸取液体•垂直吸液(吸液时，移液器本身的倾斜导致吸液的不准确)•吸头需浸入液面以下3mm•控制钮的释放要慢•高精度吸液，可先用样液预润吸头内壁2－3次第四步：放出液体•完全打出，吸头尖靠内壁，排出最后的液滴•按钮待液体完全打出后再放松常见的不正确操作方式×装配吸头时用移液器反复撞击吸头，以上紧√插入吸头时，左右轻轻旋转上紧吸头×吸头与移液器不匹配，影响气密性√选用与移液器匹配的，有质量保证的吸头×吸液时，移液器本身倾斜√垂直吸液×吸头内含有未打出的液体时，移液器平置于桌面√将移液器垂直挂在移液器支架上×用大量程的移液器移取小体积的液体√移液体积需要保证在移液器所提供的量程范围之内才符合不准确度和不精确度的要求×吸取具有强挥发性的液体√如果一定要吸取强挥发性的液体，应该在移液结束后立刻拆开移液器，让蒸汽挥发×吸液和放液速度过快√慢吸慢放移液器长期不使用时，请将刻度调整至最大值离心机的正确使用•离心机与离心机之间至少间隔30厘米,以防干扰离心机散热•离心机远离水槽或其他潮湿的装置•离心过程当中不要试图打开离心机盖--当然,也不可能•任何阻挡空气入口出口的举措都会大幅度降低离心机制冷功能•负载必须平衡，相对离心管类型要一致，注意转子上关于最大负载的信息,永远对称摆放离心管,并平衡重量•离心前封禁离心管盖，否则离心时管盖弹开会损害离心机•转子和转子盖必须旋紧，否则严禁离心•最大转速时离心物质的密度不可超过1.2g/ml•离心机用完后关上电源，保持盖子打开，不要扣紧故障排除•当发现离心时离心机在移动，应该怎么办？这时候应该立即按停止键，马上远离离心机直到离心机停止运动•如果离心机发现忘记该或者旋紧转子盖，应该怎么办？按停止键，等待离心机停止运转，然后正确盖上转子盖并旋紧日常维护1.过夜或长期不用时请打开离心机盖，让水分自然蒸发。2.不要使用丙酮，腐蚀性溶液或含有氯离子的溶液进行清洁。氯离子的溶液经常会引起腐蚀，如次氯酸钠(家用漂白粉)3.如果有难以去除的污渍，请使用塑料刷，不要使用有钢丝或磨砂类的物品清洁PCR仪•仪器在高温运行时，请勿打开盖子，以免烫伤•程序运行前，切记一定要盖紧盖子•程序结束后，打开盖子前，注意一定要先释放盖子压力(在压力没有被释放前，一定不能打开盖子)•当只有较少的样品置于模块中时，为保证压力热盖对样品施力的平均，需在模块四个角落分别放置一个空的PCR管，也可防止压力过重而对样品管造成损害•结束程序后，不要立即关掉仪器的电源，直到模块和压力热盖的温度与室温一致时，才能关掉电源•两次程序之间应该间隔至少半个小时•避免爆炸性、易燃的、挥发性的液体•不需要在样品管和模块孔之间涂抹润滑油之类的来促进温度的传递，如果仍决定用，一定不要用硅酮油酯，矿物油可以•PCR仪不要与大功率的电器共用电源，否则很容易因为高压电的不稳定，在运行过程中重启日常维护：•仪器不需要定期的维修，但是仪器外壳需要定期的清洁，用干净柔软的毛巾进行擦拭，不要用强洗涤剂或有机溶剂来清洁•通风口位于仪器的底部，注意通风口不要被堵塞，定期用软毛刷去除通风口的灰尘•模块板可以用75%的酒精擦拭•不用的时候，将盖子放下CTAB提取DNA注意事项：•仪器不需要定期的维修，但是仪器外壳需要定期的清洁，用干净柔软的毛巾进行擦拭，不要用强洗涤剂或有机溶剂来清洁•通风口位于仪器的底部，注意通风口不要被堵塞，定期用软毛刷去除通风口的灰尘•模块板可以用75%的酒精擦拭•不用的时候，将盖子放下转化结果分析（1）有菌落，说明转化成功，但有两种可能性：其一，质粒自身环化；其二，重组成功。（2）无菌落，说明实验没成功。（3）菌落布满如苔样，可能是抗生素浓度不够或失效。（4）出现大菌斑，大多数是霉菌污染所致。转化失败的原因1、平板中的抗生素部分失效，长出的克隆是杂菌。2、倒Ka平板时，培养基太烫，应冷却到50℃以下加Ka抗生素。2、涂板时来回用力过大，涂布环或者涂布棒灼烧过热，或不待冷却就涂布。3、感受态细胞长时间处在常温状态，会严重影响其转化，操作时动作迅速。4、操作时动作过于剧烈，减少对细胞的机械损伤。切记感受态细胞比较娇嫩。5、操作过程不规范，染菌。农杆菌介导基因转化效率因素1农杆菌菌株类型不同菌株对同一种目的材料的感染能力不同.其主要原因是农杆菌吸附数目与菌株类型有关,而吸附是农杆菌感染植物细胞的最初步骤2植物基因型及外植体类型一般认为,基因型的特异性与细胞的生理状态有关,具体来说与细胞受伤后的生理反应(分泌酚类化合物),细胞内源激素水平,细胞壁的结构(影响细菌的吸附)等有关.从组织培养的角度讲,所选的外植体必须具有较高的再生能力.3培养方法农杆菌介导的转化要经过3个主要步骤:外植体接种农杆菌、与农杆菌共培养、外植体在含有抑菌抗生素和选择抗生素的培养基上培养.因此、菌液的浓度（OD值）、侵染的时间和共培养的条件(温度、时间、光照、培养基的pH值等)、以及共培养之后的筛选方式等都会影响转化效率农杆菌介导的转化方法主要作用于外植体表层细胞,所以只有再生植株的细胞起源于表层才能顺利获得转化植株,否则转化效率较低概念：在同一载体上同时携带多个外源基因，比如同时含有抗生素抗性基因、草甘膦抗性基因和抗虫基因的表达载体称之为多基因表达载体。目的：为了克服费时费力，共转化频率低，减少载体数量，增大载体容量、后代中目的基因分离、重组等问题。多基因载体表达的构建可以采取6种方式方法：策略一：多启动子表达载体原理：基因克隆到同一个表达载体上,一是直接将多个基因融合克隆到表达载体上（多聚蛋白酶法），二是将多个目的基因用表达结构隔开（独立表达盒法）。通过多个基因一个表达载体的方法一次性转化植物，从而获得多基因聚合的转基因植物。优点：简便缺点：①内部启动子占据载体上有限的克隆空间②启动子间相互干扰，造成不同基因的表达水平不一致策略二：剪切载体原理：利用一个启动子，在外源基因两侧提供剪切供体/受体位点，通过剪切初始转录本，形成不同的mRNA，分别表达两个基因缺点：可变剪切机制未明，双基因表达效率很不稳定策略三：表达融合基因原理：两基因用linker（多选择中性疏水氨基酸）或直接相连，使用同一开放阅读框，翻译产生嵌合的一个双功能融合蛋白分子优点：翻译水平等量表达，常用于阳性/阴性双选择标记载体、筛选标记/报告基因载体的构建缺点：①可能由于构像的改变使其中一个或两个基因的功能受到影响②若两基因产物有不同的细胞定位，也会影响基因的正常功能。也就是说表达平衡，而功能并不平衡策略四：基因之间以IRES序列连接原理：内部核糖体进入位点（IRES）序列来源于某些病毒和细胞的mRNA5‘端的一段非翻译区。在上游启动子的控制下，该序列及与之相连的基因可同时转录，并以不依赖帽的方式启动远端mRNA的翻译，从而在同一转录本上翻译出不同的蛋白优点：①克服了双启动子之间相互抑制的现象②简化了传统的双启动子表达盒模式繁琐的阳性克隆筛选过程③可以拓展到构建双IRES序列三表达基因载体不足：转录等量，翻译独立。以IRES启动的翻译效率较帽依赖的翻译效率低。置于IRES下游外源基因的表达量是其上游帽启动翻译基因的20%-50%。策略五：基因之间以Furin的切割靶点序列连接原理：Furin是一种广泛存在的胞内蛋白酶，定位于高尔基复合体，在真核生物高度保守，可识别各种分泌型蛋白前体的精-X-精/赖-精氨酸共有序列并在此位点对其进行切割。利用这一点，将编码切割位点的连接子置于分泌蛋白或膜结合蛋白的cDNA序列间，转录时可以得到一条单顺反子，翻译成嵌合的融合蛋白，在加工过程中Furin切割成各个分离的蛋白产物，进而进行分泌性表达。特点：可以多基因表达。表达蛋白的摩尔比由载体上的编码序列数决定策略六：基因之间以2A序列连接原理：2A是一种具有自我加工能力的蛋白酶，在不同病毒中它的长度、作用位点各不相同。在口蹄疫病毒中的2A序列有长短两种类型，长型有201bp，编码39个氨基酸，短型有96bp，编码17个氨基酸。两者作用相似，均可独立的用于构建多基因载体。将两基因分别克隆到2A序列的两侧，去除上游基因的终止密码形成单一的开放阅读框，翻译出的多聚蛋白可在编码2A区域的C末端被切割为两个蛋白，上游蛋白融合了2A的C端多肽，并释放出完整的下游蛋白。主要构建流程在CTAB背面导入方法：不同的基因转化方法都有各自的优点和不足,在选择时要遵从转化率高!快速!重复性好!简单方便!易于操作等原则对于构建的多基因载体,除此之外还得要尽量使串联在一起的目的基因在转化时不发生分离或丢失,能共同整合到受体基因组中另外,不同的转化方法能导入的目的DNA的大小也不同利用Ac心s转座系统可导入长为10kb的DNA[27,利用农杆菌介导的转化系统能将长达150kb的目的DNA完整地导入植物中[28,而基因枪法一次能导入多达12一14个不同的质粒,总长大约为600kb的DNA129]130当按照上述策略设计并构建好合适的表达载体后,经过农杆菌介导或将裸露的DNA通过物理和化学直接导入的方法,采取一次!多次或者共转化的途径将多个目的基因导入到受体植物基因组中目前用于植物转基因的方法很多,比如运用农杆菌质粒!病毒!脂质体等作为载体的方法;还有包括电击法!基因枪法!花粉管导入等直接导入法