塘房桔褐斑病病菌生物学特性研究

塘房桔褐斑病病菌生物学特性研究摘要：柑橘褐斑病是由链格孢属引起的一种真菌病害。在对塘房桔褐斑病致病菌生物学特性研究中，分离并纯化塘房桔褐斑病病原物，通过科赫法则验证并确定病原菌，并对其生物学特性进行研究，为今后的病害控制提供理论基础。为此，本实验控制不同条件对相同致病菌的菌丝生长情况进行深入研究。研究结果表明，相同塘房桔褐斑病致病菌在不同条件培养下，存在差异。甘露醇为碳源时，菌丝生长最好，氮源为甘露醇时有利于菌丝生长，菌丝生长情况最好的是偏中性的培养基，低温不适合菌丝生长，30℃菌丝生长情况最好，病原菌菌丝生长偏好光照。关键词：塘房桔褐斑病链格孢菌丝生长不同条件第一章前言桔，是桔、柑、橙、金柑，柚、枳等的总称，柑橘原产中国。柑橘是世界第一大果树品种。在世界百果中，其种植面积和产量均居首位。柑橘褐斑病是由链格孢属引起的一种真菌病害，链格孢属(Alternariasp．)真菌【1】，是引起植物病害的重要真菌类群之一。目前链格孢菌侵染柑桔造成的病害【2】报道还很少。链格孢菌引起柑桔褐点病与Allbinism白化病，链格孢菌导致粗皮柠檬叶斑病、柑桔茎端腐烂病和柑桔黑腐病【3】，链格孢菌也是柑桔流胶病的致病菌之一【4】，刘娟等人在西南地区的柑桔园中发现枳橙幼苗猝死，经过分离纯化得到3株链格孢菌，其形态特征和致病存在差异【5】。链格孢菌引起的柑桔病害不仅影响柑桔的生长发育，减少产果量，而且降低柑桔果实品质，严重影响柑桔生产和果农的积极性。柑桔链格孢菌主要侵染柑桔的幼果、叶片、嫩枝及成熟果实，侵染叶片，表面产生褐斑和黄色晕圈，晕圈带有一个尾巴，这个尾巴会顺着叶脉一直延伸，形成一个眼状斑点。病原菌通过叶脉在各种管状组织中传送毒素，造成嫩梢等其他组织的损伤。侵染果实，严重时会导致幼果脱落；贮藏期间可引起果实黑腐病【6】。侵染幼苗，可造成茎端腐烂，严重时幼苗枯死。塘房桔是近10年来云南省马关县境内选育并大量推广种植的晚熟鲜食品种。近10年来，塘房桔已成为云南省马关县调整农业生产结构中的一个新的经济增长点，至2007年底。塘房桔的种植面积发展到584.5平方公顷，总产量达950t，总产值达344万元。随着种植规模的迅速发展和种植时间的延长并改原来粗放管理为园艺式的集约化栽培，栽培生态的变化和管理的滞后，致使柑橘病害逐年加重。自2007～2008年始柑橘褐斑病和炭疽病【7】大规模流行。由于防治措施不利，2008年较上年减收约200万元并呈逐年恶化趋势，成为生产上亟待解决的难题。目前对塘房桔病菌的研究很少，张玉洁，张志信，杨绪旺等人从云南马关发生的一种柑橘褐斑病的病理组织中分离得到1株病原菌,对其培养性状和形态特征进行初步研究[8]。第二章材料与方法1实验材料1.1本实验材料采自云南省马关塘房村的塘房桔种植园基地。1.2实验试剂95%无水乙醇、75%无水乙醇、蒸馏水，Hcl、NaOH、葡萄糖、甘露醇、乳糖、麦芽糖、蔗糖、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、甘氨酸、硝酸钠、琼脂等。1.3实验仪器试管、电子天平、PH试纸、烧杯、标签纸、量筒、胶头滴管、塑料袋、剪刀、滤纸、培养皿、酒精灯、接种针、载玻片、盖玻片、血球计数板、高压蒸汽灭菌锅、无菌操作工作台、恒温培养箱等。2实验方法2.1菌株的分离和纯化参照方中达[72]的方法。分离时，从褐斑病典型病斑（见图2.1）切取一小块病组织，用70％的酒精浸泡几秒钟，转移到0.1％的酸性升汞水溶液中浸2min进行表面消毒；然后用灭菌水冲洗3次，将其移置在PDA培养基上（见图2.2），室温培养。培养数天后，用接种针挑取少量菌株分生孢子（见图2.3），置于滴有灭菌水的凹玻片上，配成孢子悬浮液，稀释后，用滴管吸取一滴悬浮液置于水琼脂上，用涂布棒将悬浮液均匀涂抹水琼脂表面，超净工作台内10倍显微镜下观察，一个视野中只有一个孢子时，然后用接种针将该孢子带水琼脂移植到PDA培养基上，室温培养。图2.1图2.22.2菌种保存在超净工作台上用灭菌接种针从平板转移少量分生孢子到事先准备好的斜面上，室温培养5-7天，等长满整个斜面后保存到4℃冰箱。2.3不同碳源、氮源对菌丝生长的影响参照郑肖兰[7]的方法，选用查理固体培养基为基础培养基，分别用等量的葡萄糖、甘露醇、乳糖、麦芽糖与蔗糖置换,配成不同碳源培养基,高压灭菌。在PDA培养基上生长5d的菌落边缘，用直径5mm的打孔器打出菌饼，接种到不同碳源培养基上，每个平板接一个菌饼，且菌丝朝下，置27℃恒温箱中培养，每个处理3次重复，整个实验重复2次（本研究所有实验均为此重复数）。第5天用十字交叉法观察，测量菌落直径。用同样的方法以硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、甘氨酸为氮源替换等质量的硝酸钠配成不同氮源培养基，做不同氮源菌丝生长实验，用如下公式计算生长速率：生长速率（mm/d）=（菌落直径-5）/d，d为接种后天数。2.4不同温度、pH对菌丝生长的影响将直径为5mm的菌饼接种于PDA培养基上，分别置于4、17、21、25、27、30、35℃共7个温度下黑暗培养，第5天用十字交叉法观察，测量菌落直径。将PDA培养基用1mol/L的NaoH和HCL溶液调节pH值，使其pH值分别为4、5、6、7、8、9、10共7个处理，将直径为5mm的菌饼接种于PDA培养基上，置于27℃培养箱中培养黑暗培养，第5天用十字交叉法观察，测量菌落直径。（方法同1.2）2.5不同光照条件对菌丝生长的影响将直径为5mm的菌饼接种于PDA培养基上，分别置于黑暗、光照、12小时黑暗12小时光照交替，27℃下恒温培养，第5天用十字交叉法观察，测量菌落直径。(方法同1.2)取孢子悬浮液0.1mL均匀涂布在水琼脂培养基上，分别置于黑暗、关照，6小时黑暗6小时光照交替，27℃下恒温培养，24h后统计孢子萌发情况。第三章结果与分析3.1不同碳源、氮源对菌丝生长的影响由表1和图1可以知，塘房桔褐斑病链格孢菌丝在不同碳源、氮源下生长速率存在差异，甘露醇为碳源时，生长速率最高，为0.9225mm/d，蔗糖为碳源时最低,为0.3975mm/d；塘房桔褐斑病链格孢菌丝在不同氮源生长速率不同，甘氨酸为氮源时，生长速率最高，为0.6625mm/d，硝酸钠次之，为0.523mm/d；硫酸铵、硝酸铵、氯化铵为氮源时，生长速率差异不大，分别为0.3875mm/d、0.3655mm/d、0.3595mm/d。00.20.40.60.81甘露醇葡萄糖麦芽糖蔗糖乳糖不同碳源条件0.92250.66750.78250.39750.715生长速率表1不同碳源、氮源对菌丝生长的影响Table1Theeffectofdifferentcarbonandnitrogensourcesonthemyceliumgrowth碳源Carbonsource生长速率(mm/d)Growthrate(mm/d)氮源Nitrogensources生长速率(mm/d)Growthrate(mm/d)甘露醇(mannitol)0.9225硝酸钠(niter)0.523葡萄糖(glucose)0.6675甘氨酸(giycin)0.6625麦芽糖(maltose)0.7825硫酸铵(ammoniumsulfate)0.3875蔗糖(sucrose)0.3975硝酸铵(ammoniumnitrate)0.3655乳糖(lactose)0.715氯化铵(ammoniumchloride)0.35952.2不同温度、pH对菌丝生长的影响由表2和图2可以知，塘房桔褐斑病菌链格孢菌丝生长在不同pH下菌丝生长速率存在差异，pH6~9时，萌发率都超过0.5mm/d，但pH7时菌丝生长速率最高，为0.57mm/d；pH5和pH10时生长速率分别为0.4975mm/d和0.475mm/d；pH4时生长速率最低，为0.38mm/d。柑橘褐斑病菌菌丝在17~35℃范围内生长都在发生，21℃和25℃时菌丝生长速率分别为0.525mm/d和0.5725mm/d；27℃和35℃时孢子菌丝生长速率分别为0.621mm/d和0.675mm/d；4℃时孢子菌丝生长最慢，生长速率仅为0.017mm/d。表2不同温度、pH对菌丝生长的影响Table2TheeffectofdifferenttemperatureandpHonthemyceliumgrowthpHpH生长速率(mm/d)Growthrate(mm/d)温度(℃)Temperature(℃)生长速率(mm/d)Growthrate(mm/d)40.3840.01750.4975170.26860.5075210.52500.20.40.60.8硝酸钠甘氨酸硫酸铵硝酸铵氯化铵不同氮源条件0.5230.66250.38750.36550.3595生长速率00.20.40.645678910不同PH条件0.380.49750.50750.570.51250.5250.475生长速率70.57240.572580.5125270.62190.525300.837100.475350.67500.20.40.60.814172124273035不同温度条件0.0170.2680.5250.57250.6210.8370.675℃生长速率2.3不同光照条件对菌丝生长和孢子萌发的影响由表3可以知，塘房桔褐斑病菌菌丝在不同光照条件下生长速率存在差异，但比较小。24小时光照时，生长速率最高，为1.115mm/d，24小时黑暗时最低,为1.04mm/d，12小时光暗交替适中，为1.08mm/d。00.20.40.60.811.2光照光暗交替黑暗不同光照条件1.1151.081.0400生长速率表3不同光照条件对对菌丝生长的影响Table3Effectofdifferentlightconditionsonthemyceliumgrowth光照light生长速率(mm/d)Growthrate(mm/d)光照1.115光暗交替1.08黑暗1.04第四章结论与讨论4.1.不同碳源与氮源条件通过对塘房橘褐斑病菌菌丝生长的测定，得出对菌丝体生长有利的碳源有甘露醇，麦芽糖，乳糖、葡萄糖4种培养基，蔗糖培养基效果最差。氮源方面，甘氨酸做氮源时菌丝生长速率最快，硝酸钠次之，硫酸铵、硝酸铵、氯化铵做氮源对菌丝生长影响差不多。这说明不同碳源，氮源的培养基对塘房桔褐斑病链格孢菌丝生长都存在着不同的影响，这可能是链格孢对碳氮源的需求存在差异。3.不同PH与温度条件从上面对控制不同PH对褐斑病链格孢菌丝生长情况的实验数据得出，不同PH的培养基对菌丝生长情况影响差不多，但菌丝生长情况最好的是偏中性的培养基。而在控制温度条件中，4℃菌丝生长速率最慢，说明低温不适合菌丝生长，30℃菌丝生长情况最好。当温度到35℃时菌丝生长速率比30℃低，从不同温度条件图表中看到，30℃以前，温度越高，生长情况越好，30℃以后菌丝生长速率有所降低。4.不同光照条件面对不同光照条件时，塘房桔褐斑病链格孢菌丝生长情况同样存在差异，24h光照生长情况最好，12h光暗交替次之，24h黑暗生长情况最差，说明病原菌菌丝偏好光照。在对塘房桔褐斑病致病菌分离纯化与生物学特性研究中，存在或多或少的问题，比如，在进行致病菌分离纯化时，出现多种病菌，不知致病菌是哪种时，就需要进行大量的验证。而在对致病菌生物学特性研究中，本实验只选取了一个方面------菌丝生长情况进行研究。希望以后能有机会进行其他方面的补充。参考文献[1]王洪凯，张天宇等．链格孢属真菌分类研究进展[J】．山东农业大学学报，2001，32(3)[2]刘娟柑桔园链格孢菌的鉴定与防治[D].柑桔研究所,2011,5[3]叶琪明等．柑桔黑腐病菌生长和产孢生物学研究[J]．浙江农业学报，2000，12(6)：387．389[4]陈时周等．柠檬流胶病原菌类型研究[J]．西南大学学报，1999，21(2)：162．165[5]刘娟;胡军华;姚廷山等．卡里佐枳橙幼苗病害致病菌的分离和鉴定[J]．2010，39(5)[6]陈绍光．柑桔保鲜贮藏技术[M]．福州：福建科学技术出版社，1989[7]张玉洁;张志信;