哺乳动物细胞自噬的研究方法

哺乳动物细胞自噬的研究方法摘要：细胞自噬参与多种生理和病理过程。因此，科学研究中需要对细胞自噬进行精确识别、定量以及对自噬过程进行操作。然而，因为细胞自噬是动态和复杂的过程，所以对其进行的分析经常是不准确的。在本文中，我们讨论监控细胞自噬和调控细胞自噬活动的方法，尤其关注哺乳动物细胞巨型自噬。前言过去十年，对称之为自噬的细胞基本生物学过程有了“爆炸”性的研究。细胞自噬过程中所必需的进化保守基因的发现（最先在酵母中确认），促使科学家揭示了一系列关于细胞自噬对内环境稳态、发育过程以及其他生理功能的影响。此外，更多的证据提示细胞自噬的异常可以引起很广泛的哺乳动物疾病(LevineandKroemer,2008;Mizushimaetal.,2008)。因此，科学家就急迫需要对多种多样生物过程中的细胞自噬进行检测及功能研究，尤其是在哺乳动物中。哺乳动物细胞自噬研究历来受两个主要因素的困扰。第一，用静态的检测手段捕获一个动态的过程本身就是一个困难，以及基于这些检测手段的生物学干预的先天性限制。第二，区分形态和功能是另一个挑战，在特定的生理条件下对细胞自噬的研究中，要避免由于检测手段的缺陷将这种生理功能认定为细胞自噬。过去我们对哺乳动物细胞自噬功能的误解主要是以上两种原因导致的。比如，在特定的神经、肌肉退行性疾病中，由于细胞自噬早期中间产物积累增多，似乎代表了细胞自噬通路后期阶段被抑制，这些疾病就被认为或部分被认为是由于细胞自噬增多引起（基于细胞自噬过程中早期中间产物数量的增多）(LevineandKroemer,2008;Mizushimaetal.,2008;Rubinsztein,2006)。细胞自噬是一种常见的细胞死亡过程中的形态特征，经常被错误的认定为是一种细胞死亡通路，然而现在可以明确细胞自噬主要功能之一是：在恶劣条件下，细胞自噬使细胞能存活(KroemerandLevine,2008)。在阐明细胞自噬分子机制过程的研究中，由于新技术方法的发展和应用，过去研究细胞自噬的部分困难被克服。因此在过去十年里，针对细胞自噬动态过程的观察和在特定细胞过程中研究调控细胞自噬功能的多种新技术应运而生。本文的目的是综述目前研究哺乳动物细胞自噬的各种实用技术以及这些技术在解释细胞自噬中的局限。关于每种技术的具体细节可以参照以下其他综述(Klionskyetal.,2008a;Mizushima,2004;MizushimaandYoshimori,2007;Rubinszteinetal.,2009)。细胞自噬引言细胞自噬是一个描述包括细胞器在内的胞浆物质进入溶酶体而被降解过程的通用术语(LevineandKroemer,2008;Mizushimaetal.,2008;Rubinsztein,2006)。在巨型自噬、微型自噬和分子伴侣介导型自噬这三种细胞自噬类型中，巨型自噬的研究最为深入。分子伴侣介导型自噬过程中，胞质蛋白借助分子伴侣的蛋白折叠效应直接跨膜进入溶酶体。微型自噬涉及溶酶体膜的内陷，膜的内陷可以使一部分细胞质进入溶酶体。巨型细胞自噬（文中以下部分简称细胞自噬）是本文关注的重点。从酵母到哺乳动物，细胞自噬是一个由自噬体介导的保守过程。起初，被称为独立膜或吞饮泡的小囊泡逐渐延伸并包裹胞浆，最后形成双层膜结构的自噬体（图1和图2）。随后，自噬体的外层膜与溶酶体融合形成自噬溶酶体，介导被包裹物质连同自噬体内层膜的降解。自噬体在于溶酶体结合之前也可以同内涵体融合。由自噬降解产生的氨基酸和其他小分子物质重新运回胞浆中被再利用或产能。以下描述的方法用于检测自噬过程的不同阶段的物质包括早期自噬体、自噬溶酶体和自噬降解产物，我们应该综合应用这些实验方法避免错误的解释实验结果，比如自噬中间产物的增多是否能说明细胞自噬的真正增加，或者自噬最后完成阶段的阻滞（图3和图4）。在生理条件下，细胞自噬具有许多重要作用比如在饥饿状态、胚胎植入前和发育过程中维持氨基酸库的稳定、抑制神经退行性病变、抗衰老、肿瘤抑制、细胞内微生物的清除以及先天固有免疫和后天适应免疫的调节(CecconiandLevine,2008;DereticandLevine,2009;LevineandKroemer,2008;Mizushimaetal.,2008;Rubinsztein,2006)。细胞自噬特征之一是它的动态调节；在基础状态下，细胞自噬水平很低，但是自噬可以被很多刺激因素明显激活。无论是从酵母到哺乳动物的培养细胞还是完整的有机体，细胞自噬最常见的诱导因素是营养饥饿。除了饥饿激活细胞自噬外，激活细胞自噬的因素还包括其他生理性应激刺激（缺氧、能量消耗、内质网应激、高温和高密度环境）、激素刺激、药物刺激（雷帕霉素等其他化合物）、固有免疫信号分子和疾病包括细菌、病毒、寄生虫感染、急性胰腺炎、心脏病和蛋白沉积。相反，细胞自噬的抑制也往往与特定疾病相联系，包括癌症的亚型、部分神经退行性疾病和感染性疾病以及炎症性肠道疾病，细胞自噬功能降低是衰老的共同特征。由于细胞自噬与多种生理和病理过程相联系，细胞自噬研究中就需要更多的科学方法来确定（1）在特定的生物环境下细胞自噬是否存在、上调或抑制；（2）细胞基础自噬和/或修饰自噬是否参与并如何调节特定的生理或病理过程。细胞自噬涉及一系列进化保守基因产物的参与，比如独立膜和自噬体形成所需要的Atg蛋白（表1）。自噬体形成分为两个主要步骤：独立膜成核阶段和延伸阶段。ULK/Atg1激酶复合物、自噬特异性PI3K激酶复合物和PI3P效应物以及同它们相关的蛋白在成核阶段起着重要作用，而Atg12-LC3/Atg8偶联系统在延伸阶段起着重要作用。此外，自噬体与溶酶体融合过程、溶酶体的酸化及溶酶体消化过程也需要其他蛋白参与，与自噬相关的具有整合环境因素的调节信号也参与这些过程中。有关自噬分子调节机制的具体细节可参考以下文献(HeandKlionsky,2009;LongattiandTooze,2009)。在哺乳动物细胞，大多数Atg蛋白（比如ULK1/2,Atg13,FIP200,Atg101,Beclin1,Atg14,LC3,Atg12,Atg16L1）分布在独立膜上，在完整的自噬体上Atg蛋白分布较少(LongattiandTooze,2009)（图1和表1）。酵母Atg8的哺乳动物同源体微管相关蛋白轻链（LC3）是目前唯一发现存在于自噬体的蛋白，因此LC3蛋白广泛用于作为自噬体的标记物（图1和图4B）(Kabeyaetal.,2000;Mizushimaetal.,2004)。对细胞自噬过程的认识极大促进细胞自噬的检测（基于LC3的生物化学和显微镜的检测方法），同样也使对细胞自噬过程的操作成为可能（通过敲出或降低自噬基因的表达或者主要的自噬抑制蛋白基因的表达）。利用化学物质干预自噬体形成或下游的降解过程也使一种操作细胞自噬过程的方法（图1）。检测细胞自噬活动细胞内自噬体数量增多总是说明细胞自噬活动增加是一个普遍存在的错误概念。因为自噬体是动态过程中的中间产物，所以在任何特定时间观察到的自噬体数量是代表自噬体产生效率和它们转变为自噬溶酶体效率之间的平衡。这样以来，自噬体的积累增多可能代表自噬活动被诱导，或者相反是由于自噬体形成的下游被阻断引起自噬体增多。比如，相对于基础水平的细胞自噬（图3A），细胞自噬激活后可以导致所有自噬中间产物的增多包括独立膜、自噬体和自噬溶酶体（图3B）。如果自噬体形成过程中的上游某个步骤被阻断，那么所有自噬中间结构产物的数量就会降低（图3C）。相反，当自噬体形成过程中的下游某个步骤被阻断，自噬结构的中间产物数量就会增多，而自噬溶酶体数量就会减少（图3D）。很明显，在这两个截然相反的情况下，自噬的激活（即增加自噬性降解）（图3B）和自噬过程下游被阻断（即减少自噬性降解）（图3D）都可引起自噬体数量增多。因此，简单的自噬体数量多少检测还不足以对自噬活动进行评估。甚者，应该利用不同的方法共同区分基础水平自噬、诱导性自噬、自噬上游水平的抑制和自噬下游水平的抑制。细胞自噬流是一个用来描述自噬体形成的动态过程、向溶酶体转移自噬性物质以及自噬性物质在溶酶体降解过程的术语。自噬流是显示细胞自噬活动的指标，比测定自噬体数量更为可靠。以下章节，我们讨论检测细胞自噬体数量和细胞自噬流的各种不同方法。自噬体数量检测目前，主要有三种方法用来定量检测自噬体数量，包括电子显微镜和光学显微镜检测LC3亚细胞定位，生物化学方法检测与自噬体膜相关的LC3。电子显微镜电子显微镜是最常用的研究方法，事实上哺乳动物细胞自噬就是1950年后期电子显微镜工作者研究溶酶体过程中发现的。在超微机构水平，自噬体被定义为是一个双层膜机构包裹着未被消化的胞浆物质，该双层膜结构没有与溶酶体融合（图2和图4A）。自噬体中经常包涵诸如线粒体和内质网碎片在内的细胞器。根据自噬体明确的定义，识别自噬体识别就很容易，因为这些细胞器包涵细胞内物质。然而，如何解释双层膜结构特异包裹细胞内病原体不是很清楚：一些病原体的生命周期经过了自噬样中间结构的转化，而最终没有进入溶酶体；在其他一些情况下，细胞内病原体进入自噬通路被溶酶体降解。自噬体传统经典定义也包括双层膜结构所包含的不同细胞内容物。这些都是巨型细胞自噬过程所描述的事情，然而还存在着细胞器特异性自噬比如过氧化物酶体自噬、线粒体自噬、核小体自噬和内质网自噬等(vanderVaartetal.,2008)。因为哺乳动物细胞存在病原体特异性和细胞器特异性自噬，与传统的巨型细胞自噬不同，所以必须对基于形态学指标的自噬体检测重新审视。相对于包含细胞内容物的自噬体而言，如何区分自噬溶酶体和具有膜结构的细胞组分经常比较困难。自噬溶酶体是由自噬体和溶酶体（或内涵体）融合而成的细胞器，具有限制性单层膜结构和包含了胞浆物质的不同阶段降解物。在早期，自噬溶酶体内容物可以识别其来源于胞浆，然而当降解比较完全时就很难识别其来源。甚者，自噬溶酶体和细胞内吞结构以及其他来源不清楚的囊泡结构之间的识别也往往很困难。尤其是没有或含有较少内容物的囊泡就不能认为是自噬结构。其他对自噬体错误解释的典型例子见以下综述(Eskelinen,2008)。尽管电子显微镜是一个强大的工具，但因其在功能研究上的潜在局限性，所以电子显微镜不是完美的研究方法，其功能研究的局限性将在下文讨论。荧光显微镜利用电子显微镜技术评估自噬体要求研究者具备相当多的专业技能，逐渐被光学显微镜和生物化学方法所替代，后两种方法相对于不同领域科研工作者更容易做到。前文提到，哺乳动物自噬蛋白LC3作为自噬体的标记物（图1和图4B）。在四种LC3同源异构体中，LC3B最常被用作标记物。合成开始不久，初始LC3的C末端被Atg4加工变成LC3-I，LC3-I的C末端含有甘氨酸残基。随后，通过泛素样酶促反应LC3-I和磷脂酰乙醇胺（PE）结合变成LC3II（LC3-PE）。LC3-I位于胞浆内，而LC3II位于自噬体外层和内层膜上（图4B）。自噬体与溶酶体融合后，外层膜上的LC3在Atg4裂解作用下离开膜，内层膜上的LC3被溶酶体酶降解，最终导致自噬溶酶体的LC3含量极低。因此，在荧光显微镜下观察到的内源性LC3或GFP偶联的LC3会弥散性分布在胞浆内，这些点状结构主要代表自噬体（图5A）。尽管细胞中的含LC3或GFP-LC3的点状结构数量可以精确测量自噬体的数量，但这种方法有一些不足。首先是存在主观性，研究者需要建立和应用统一的标准来制定定量的方法和对斑块的定性标准。斑块结构的数量可以人工计数（要求计数人对实验条件不清楚）或者用电脑图像分析软件自动计数（TopHatalgorithmofMetaMorphversion7.0byMolecularDevices,andG-CountbyG-Angstrom）。自噬激活后，这些斑块数量会明显增加，然而在正常情况下也会观察到少量斑块（图5A）。因此，含有GFP-LC3斑块的细胞有百分之多少的可能性是细胞自噬，这个标准并不合适（理论要求100%），除非建立一个清楚的可