器官移植体液免疫理论的100年历史回顾

器官移植体液免疫理论的100年历史回顾PaulITerasakiTransplantationVolume93,Page751-756,April2012摘要:体液免疫理论指的是抗体造成移植物排斥。1917到1929年间,大量的研究集中在发现及研制抗肿瘤的抗体方面。后来的事实证明:通过移植肿瘤获得的抗体是针对移植物抗原的,而并非针对肿瘤的特异性抗原。为此,近系小鼠的实验模型应运而生,并在此过程中发现了小鼠的H-2位点及相关的移植抗原。相对应的抗体为红细胞凝聚的并有细胞毒作用的抗体。例如,由于抗原不同,孕妇可产生抗胎儿的抗体。通过分析淋巴细胞毒抗体与抗原的反应,人类发现和建立了HLA系统(人类白细胞抗原系统)。此后,人们发现针对HLA抗原的抗体可造成肾移植的超急排斥,急性排斥和慢性排斥。几乎所有肾移植排斥的患者都存在抗体。现在,Luminex单一抗原微珠技术能够在血清肌苷升高和移植物排斥前检测出供者特异性抗体,既针对供者抗原的特异性抗体。现已证实,抗体的出现及性质,不但可以预测肾移植的失败,而且可以预测心脏移植,肺移植的失败机率。例如,没有存在抗体的移植患者,其存活率比存在抗体的患者高4年。新的证据表明,肝移植和胰岛移植也存在抗体介导的慢性排斥。目前,四项研究已经证实,清除或降低抗体可提高移植存活率。如果抗体的清除可以防止慢性移植物失功,体液免疫理论便最终得到确定。关键词:Humoraltheory,HLAantibodies,Historyofhumoraltheory(Transplantation2012;93:751-756)前言体液免疫理论强调抗体是移植排斥的主要原因。该理论的发展和确定伴随着历史上大量的无可争辩的证据。然而，像所有的历史一样，对证据的判定，阐述和结论无法避免主观的影响。这也是为什么我们这些接受体液免疫理论的人还在不断地探索并报告令人信服的证据和结论。需要提醒的是，体液免疫理论的历史从未包括细胞方面的免疫反应。理由是：不管细胞免疫多么重要，其与体液免疫理论的发展关系并不紧密。移植物排斥是个复杂的过程，涉及诸多因素。我在这里强调抗体的作用是因为抗体极可能是引发其它连锁反应的关键因素，包括激发细胞免疫反应。八年前，我在综述体液免疫理论时曾呼吁坚持细胞免疫理论的人也能够写一篇细胞免疫理论的综述。如果大量的证据支持细胞免疫理论，该理论应该得到论证及确定。另一个值得提醒的地方是，Medawar明确支持细胞免疫理论。很多人可能认为，支持体液免疫理论会是对Medawar本人的抨击。50年前，我是Medawr的学生。为此，我深感荣幸。我至今认为，当初在Medawar实验室工作时获得的激励和鞭策对我整个事业的影响是巨大的。我相信，如果Medawar活在今日，他对细胞免疫的观点一定会有改变。科学的进步不会一帆风顺。需要一步一步地前进。但每一步前进或每一个突破都是基于新观念或新技术的引进。可能某一步前进是巨大的。例如，成千上万的论文和无数问题的解决基于的是PCR(聚合酶链反应)技术的引进。相比之下，器官移植体液免疫理论的发展基于是很多小的前进步伐。历经100年的探索。其进展可分为三个阶段。每个阶段大约40-50年。1900年，Landsteiner发现了红细胞ABO系统。但该系统不是与器官移植相关的组织相容系统。所以，器官移植体液免疫理论发展的第一步应该是1914年染料排除试验的建立。该检测方法可在体外鉴定细胞的存活或死亡。从而可鉴定出细胞毒抗体。第二步发生在50年后的微量淋巴毒检测方法的建立。该方法至今仍在应用。只是在配型方面，分子生物学方法已成为主要的检测手段。这个阶段经历了40年，直到几年前单一抗原微珠方法的建立。该技术通过重组细胞株获得纯化的抗原。HLA系统的多态性表现在众多不同的抗原/抗体特异性。单一纯化抗原可确定单一抗体的特异性。从而使监测移植后抗体的出现，尤其是针对供者的特异性抗体(DSA),成为可能。以下是对体液免疫理论发展三个历程的具体描述。染料排除实验Pappenheimer首次报告锥虫蓝（TrypanBlue）排除实验，既被抗体和补体破坏的细胞被染为蓝色：而没有被染色的细胞为活细胞[1]。目前检测抗体的技术仍参考这样相对简单的方法。1913年到1929年期间，肿瘤免疫方面的研究主要集中在提高机体对肿瘤的免疫力。为此，锥虫蓝染色或曙红染色实验被普遍应用，以确定肿瘤细胞是否被抗体消灭[2]。1929年，Woglom综述了自1913年以来发表的有关移植肿瘤的600篇学术论文[3]。例如，将大鼠肉瘤移植到豚鼠身上会导致豚鼠对大鼠肉瘤的免疫排斥。但大鼠的皮肤和血液同样具有免疫原性。由此提示，豚鼠产生的免疫性并非针对肉瘤，而是针对大鼠的组织[4]。Ruo（鲁斯）发现，来自鸡鲁斯肉瘤致敏的鹅血清，其表现的免疫性不同于对细胞的免疫性。后来发现，对肿瘤的作用实际上来自一种病毒，既鲁斯肉瘤病毒[5]。众多的类似研究，既希望动物体内产生抗肿瘤抗体，其结果使科研人员最终认识到：移植肿瘤确实可产生抗体，包括同源或非同源。但其免疫性并不是针对肿瘤本身。也就是说，机体排斥的不是肿瘤，而是移植物的组织。长期来探索的肿瘤免疫实际上仅是对移植抗原的免疫。尽管结果令人沮丧，但可明确地证实抗体导致移植物排斥。为了解决肿瘤特异性的问题，上个世纪30和40年代，人们建立了小鼠的纯系株。Gorer和Schutze通过纯系鼠发现了小鼠的H-2组织相容位点[6]。他们发现，针对A系小鼠的兔血清抗体不能与C57/bl小鼠发生反应。这是一项重大的突破。他们进一步证实，机体对肿瘤的反应受抗原类别的影响，而抗原类别可通过抗血清（血清抗体）得以确定。此后，Snell通过移植肿瘤确定了小鼠的，由他起名的组织相容位点（H-2）[7]。这一历史性的发现使他获得了诺贝尔奖。如果Gorer没有去世的话，非常可能他会分享这一殊荣。自1950年，我开始研究针对移植的Brown-Pearce兔肿瘤细胞的同种异体抗体。1953年，Kalfayan和Kidd发表了类似的研究结果。我觉得，他们的研究比我做得好。在证明移植抗原时，红细胞凝聚抗体很有帮助[9]。细胞毒抗体也在Gorer和Amos的淋巴瘤研究中得到描述[10]。移植抗体的检测技术和方法受到了重视。有关这方面的论述来自三篇重要的文献。每篇间隔一年[11-13]。结论是：红细胞凝聚试验实际上检测的是同一的抗体。Amos等在皮肤移植的小鼠体内发现了抗体的存在[14]。随后，皮肤移植的鸡体内发现有淋巴细胞凝聚素[15]，以及皮肤移植的兔体内发现有细胞毒抗体[16]。此外，补体在免疫反应中的作用也受到了重视[17]。然而，问题仍然存在，既这些抗体是否在体内攻击移植物？对这一问题最令人信服的答案可参考Stetson和Demopoulos在1958年发表的论文[18]。他们证实，将同种异体抗体注射到小鼠体内，移植的皮肤颜色转为苍白。此后，我们的研究表明，将同种异体抗体注射到小鼠的肾动脉里可导致肾脏失去功能[19]。当时用的检测方法是摄取邻碘马尿酸钠。但当时由于技术上的原因,抗体注射后不能有效止血,一些注射正常血清的小鼠肾脏也出现功能受损。1958年，在血库工作的Dausset发现：接受多次输血的患者可产生抗白细胞抗体[20]。Dausset作为第一个发现人类白细胞抗原（HLA）而获得诺贝尔奖。此后，其它血库的科研人员陆续发现不同的HLA。荷兰的VanRood等开始用白细胞凝聚实验确定HLA[21]；美国斯坦福大学的Payne和Rolfs开始研究妊娠血清，并发现妊娠血清中存在由胎儿刺激产生的HLA抗体[22]，因胎儿的HLA与母亲的HLA不具相容性。微量淋巴细胞毒检测到了1964年，由于越来越多的研究机构开始研究人类组织相容性，由此促成了第一届国际组织相容研讨会。BernardAmos出任大会主席，地点在美国的杜克[25]。大会的主要议题是：哪种方法是检测HLA的最好方法。当时，白细胞凝聚试验最为普遍。我们在会上介绍了微量淋巴细胞毒实验方法。该方法只用一微升(onelambda)试剂和同样微量的淋巴细胞。为了更快，更精确地确定HLA抗原，并报告给国际组织相容研讨会，各实验室间开始了血清交换及比较。由于微量淋巴细胞毒方法可使一毫升血清检测1000个标本或1000次试验，避免了大量血清的流动。1970年到1984年间的国际组织相容研讨会报告了诸多新的抗原。Ceppellini等在1967年的第三届国际组织相容研讨会上报告：所有观察到的抗原抗体反应均涉及到一个共同的遗传基因位点[27]。该结论受到了高度的评价。1968年，世界卫生组织召开了第一次对新抗原的命名会议，并命名这个基因位点为HLA。这个新位点的命名基于的是对抗体（直接针对移植抗原的抗体）的认识。此种抗体来自于人与人之间的免疫反应。因此，HLA抗原的发现直接源于体液免疫理论。通过微量细胞毒检测方法，我们报告了第一例抗体介导的肾移植急性排斥[28]。之后，Kissmeyer-Nielson等根据白细胞凝聚实验方法报告了两例他们称为的肾移植“超急排斥”[29]。因为当时交叉配型试验尚未开始应用，出现超急排斥的病例很多。我们对初始报告的30例急性排斥进行了总结。发现24例（80%）患者交叉配型结果为阳性[30]。Starzl和Williams等随后将此种排斥归类于超急排斥[31,32]。这些临床观察首次提出了令人信服的证据，既：抗体可在移植后数分钟内将移植物排斥掉。体液免疫的理论推断为：如果抗体导致移植物排斥，排斥发生后应该能检测到抗体。Morris等在1968年首次报道了肾移植排斥前后存在抗体[33]。当时，Morris往返于Richmond和我们的实验室,研究肾移植排斥与抗体的关系。我们发现，这些导致排斥的抗体为DSA(DonorSpecificAntibody)，既供者特异性抗体[34]。Jeannet等在1970年报道了同样的发现[35]。之后的证据进一步表明，术前存在抗体的肾移植患者可发生急性排斥，既排斥发生在移植后4个月内[36]。随后的40年，大量的临床数据反复验证了抗体与早期排斥的关系。目前，只要肾移植患者术前存在HLA抗体，就会被注明“高危险”。所有这些均基于细胞毒检测。但该方法正在逐渐被更敏感的流式细胞仪检测所取代[37]。例如，我们在1987报道了52例细胞毒检测阴性，但流式细胞仪法阳性的肾移植患者。其中33%的患者其移植物在术后一个月内被排斥掉。而另外一组流式细胞仪检测阴性的患者，一个月内的移植失败率为8%[38]。以后的类似研究显示：148名流式细胞仪检测阳性的肾移植患者，一个月内的移植失败率为20%[39]。此外，即便患者的抗体在移植前呈弱阳性反应，对移植物的危害也是显著的。目前，DSA（供者特异性抗体）的检测意义已经获得了公认。通过检测患者DSA而排除抗原相对应的供者，再加上敏感的交叉配型试验，移植前被致敏和没有致敏的肾移植患者，其存活率相同。即便是再次移植，其存活率也与首次移植的存活率相同[40]。通过非血清学方法确定移植物排斥抗体存在的早期方法是通过活检检测C4d。C4d染色阳性的患者，其存活率低于C4d阴性的患者[41]。许多研究证实了类似的结果。但最近的一些研究表明，许多抗体介导的排斥病例，C4d检测结果为阴性[42]。尽管如此，C4d染色可证实抗体破坏肾脏毛细血管方面的作用。如果抗体导致移植失败，人们应该能够从排斥的肾脏上洗脱下抗体，以证实抗体确实存在。试验表明，从超级排斥的肾脏上可通过洗脱技术获得HLA抗体[43]。同样的结果也见于慢性排斥的肾脏。体液免疫的新的实验证据仍在陆续报道。例如，同种系的小鼠心脏移植，如果将导致超免疫(hyperimmunized)的血清注入给小鼠，可导致心脏血管的损伤，由此证明抗体在体内的作用[44]。另一项很有说服力的研究来自猕猴肾移植实验。首先，针对供者的抗体被发现。然后，出现C4d沉积，继而发生肾小球损伤，最终导致移植失败[45]。通过这些研究，人们不难发现：抗体的首先出现引发了随后的各种反应及病理